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Second Generation Model Complexes for the Enzyme Purple Acid Phosphatase

Zajaczkowski-Fischer, Marta

German Title: Modellkomplexe der zweiten Generation für das Enzym Purple Acid Phosphatase

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Abstract

The present thesis is concerned with the development and characterization of new diferric purple acid phosphatase (PAP) model systems, which include functional groups that are meant to act as a second coordination sphere in phosphoester hydrolysis. A short review on purple acid phosphatases, including the postulated reaction mechanisms in phosphoester hydrolysis, and published PAP model complexes is given in Chapter 2. Furthermore, important data regarding published bridged diferric complexes are presented, in order to have a basis for interpretation of the analytical data in the results part. In Chapter 3, the results on the new model complexes are presented and discussed. At first, the cyclam-based ligand L1 and its coordination chemistry are described (Chapter 3.1). The most important findings are the following: Ligand L1 predominantly forms a mu-oxo bridged diferric complex when reacted with [FeCl4]- in situ. This complex, called K1, can readily coordinate phosphate and inactive phosphoesters, also in partly aqueous solution. Interestingly, the inactive phosphodiester diphenylphosphate (DPP) coordinates in a monodentate mode to one FeIII, whereas the monoesters para-nitrophenylphosphate (pNPP) and 1-naphthylphosphate (1-NP) bind in a bridging mode to both FeIII centers. The monodentate coordination of DPP is encouraging in terms of the intended reactivity in phosphoester hydrolysis, as this coordination mode is believed to be the active one, leading to a terminal hydroxide as a possible nucleophile. Chapter 3.2 deals with the phenolate-based ligands HL2 and H3L3 and their coordination chemistry. These ligands are derivatives of the published HBPMP ligand and incorporate amino and amido functional groups as second coordination sphere mimics. Diferric complexes, called K2 and K3, are obtained by in situ reaction of the ligands with a ferric salt. A spectrophotometric pH titration was performed and revealed the pH dependent species distribution and the corresponding pKa values of the complex solutions. K2 has three equilibria between pH 4.6 and 11, where the second equilibrium is the deprotonation of the second coordination sphere amines. In contrast, K3 has only two equilibria due to the low pKa of the amido protons. Regarding the coordination of phosphoesters, K2 shows a similar behavior to K1. DPP is coordinated monodentately to one FeIII, whereas pNPP and 1-NP form bridging complexes. This is not observed with K3, which shows bridging coordination with both, mono- and diesters, possibly due to the lack of hydrogen bond donors in the second coordination sphere. The complexes K1, K2 and K3 were tested for hydrolytic activity towards the activated phosphoester substrates bis-(2,4-dinitrophenyl)phosphate (BDNPP) and 2,4-dinitrophenylphosphate (DNPP). The results of these experiments are presented in Chapter 3.3. K1 and K2 are the first examples of PAP model complexes that catalyze the hydrolysis of the phophomonoester DNPP. So far, only diester hydrolysis with PAP model complexes has been reported in literature, while the inactive bridging coordination mode is observed for phosphomonoesters. We draw the fact, that K1 and K2 can hydrolyze monoesters, back to the hydrogen bonding interaction of the coordinated substrates to the remote ligand parts. A closer analysis of the reactivity of K1 towards DNPP and BDNPP, based on DFT calculations, shows that 1) BDNPP is stabilized by the interaction with the protonated cyclam in the monodentate coordination mode, 2) the hydrolysis of DNPP has a significantly lower activation barrier with the hydrogen bonding interactions than without and 3) this barrier is lower than the energy barrier to a bridging coordination mode. As a conclusion, a mechanism is proposed, where the substrate binds in a monodentate coordination mode and is subsequently attacked by a terminal hydroxide. This active species is in equilibrium with the inactive bridging complex. In the case of the diester BDNPP, the equilibrium is shifted to the active species, while the monoester DNPP is more stable in the bridging coordination mode. The hydrolysis product remains bound to K1 and inhibits catalysis.

Translation of abstract (German)

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Charakterisierung neuer zweikerniger FeIII Komplexe als Modelle für das Enzym Purple Acid Phosphatase (PAP), die zusätzliche funktionelle Gruppen tragen, welche als zweite Koordinatiossphäre die Hydrolyse von Phosphatestern beschleunigen sollen. Eine kurze Übersicht über PAPs und die postulierten Reaktionsmechanismen in der Phosphatesterhydrolyse sowie über literaturbekannte PAP Modellsysteme wird in Kapitel 2 gegeben. Zusätzlich werden die Eckdaten von verbrückten zweikernigen FeIII Komplexen im Hinblick auf die Interpretation der analytischen Daten im Ergebnisteil beschrieben. In Kapitel 3 werden die Ergebnisse der Arbeit präsentiert und diskutiert. Zu Anfang wird der Cyclam-basierte Ligand L1 und seine Koordinationchemie behandelt (Kapitel 3.1). Die wichtigsten Erkenntnisse sind: Der Ligand L1 bildet bevorzugt einen mu-oxo-verbrückten zweikernigen FeIII Komplex, genannt K1, wenn er mit [FeCl4]- in situ umgesetzt wird. Phosphat und inaktive Phosphatester koordinieren bereitwillig an diesen Komplex. Interessanterweise werde unterschiedliche Koordinationsmodi des inaktiven Phosphatdiesters Diphenylphosphat (DPP) und der Monoester para-Nitrophenylphosphat (pNPP) und 1- Naphthylphosphat (1-NP) beobachtet: DPP koordiniert als monodentater Ligand an nur ein FeIII, während die Monoester als verbrückende Liganden an beide FeIII Zentren binden. Dieses Ergebnis ist ermutigend im Hinblick auf die beabsichtigte Aktivität in der Phosphatesterhydrolyse, da der monodentate Koordinationsmodus als die aktive Form angesehen wird und von einem terminalen Hydroxid als mögliches Nukleophil angegriffen wird. Kapitel 3.2 beschäftigt sich mit den Phenolat-basierten Liganden HL2 und H3L3 und deren Koordinationschemie. Diese Liganden sind Derivate des literaturbekannten HBPMP Liganden und tragen zusätzliche Amino- und Amidogruppen als zweite Koordinationssphäre. Die K2 und K3 genannten zweikernigen FeIII Komplexe werden durch in situ Reaktion der Liganden mit einem FeIII Salz erhalten. Spektrophotometrische pH Titrationen der beiden Komplexe liefern die pH-abhängige Verteilung der verschiedenen Spezies und die dazugehörigen pKs Werte. K2 liegt zwischen pH 4.6 und 11 in drei Gleichgewichten vor, wobei das mittlere Gleichgewicht der Deprotonierung der zusätzlichen Aminogruppen entspricht. Im Gegensatz dazu findet man bei K3 nur zwei Gleichgewichte, da die zusätzlichen Amide bereits bei niedrigen pH Werten deprotoniert werden. In Bezug auf die Koordination von Phosphatestern verhält sich K2 ähnlich wie K1: DPP bindet monodentat an ein FeIII, wohingegen pNPP und 1-NP als verbrückende Liganden an beide FeIII Zentren koordinieren. Dieses Verhalten wird bei K3 nicht beobachtet; stattdessen binden sowohl Mono- als auch Diester als verbrückende Liganden. Dies ist vermutlich auf die fehlenden Wasserstoffbrücken-Donoren in der zweiten Koordinatiossphäre zurückzuführen. Die Komplexe K1, K2 und K3 wurden in der Hydrolyse der aktivierten Phosphatester Bis- (2,4-dinitrophenyl)phosphat (BDNPP) und 2,4-Dinitrophenylphsophat (DNPP) untersucht. Die Resultate dieser Experimente werden in Kapitel 3.3 dargestellt. K1 und K2 sind die ersten PAP Modellkomplexe, die die Hydrolyse des Monoesters DNPP katalysieren. Bisher wurde in publizierten Arbeiten mit Modellkomplexen nur Diesterhydrolyse gefunden. Bei Phosphatmonoestern wurde nur die inaktive verbrückende Koordinationsform beobachtet. Wir führen die Fähigkeit von K1 und K2, Phosphomonoester zu hydrolysieren, auf den Einfluss der zweiten Koordinationssphäre durch Wasserstoffbrückenbindungen zu den koordinierten Substraten zurück. Eine nähere Betrachtung der Reaktivität von K1 mit DNPP und BDNPP mit Hilfe von DFT Methoden führte zu folgenden Ergebnissen: 1) BDNPP wird durch die Wasserstoffbrückenbindungen zum protonierten Cyclam in der monodentaten Koordinationsgeometrie stabilisiert, 2) die Hydrolyse von DNPP hat mit den Wechselwirkungen zwischen Substrat und zweiter Koordinatiossphäre eine deutlich niedrigere Aktivierungsbarriere als ohne und 3) diese Barriere ist kleiner als die der Reaktion zum verbrückenden Substrat. Zusammenfassend wird ein Mechanismus postuliert, bei dem das Substrat monodentat an ein FeIII gebunden ist und von einem terminalen Hydroxid nukleophil angegriffen wird. In Konkurrenz dazu steht das Gleichgewicht zum inaktiven verbrückenden Koordinationsmodus. Für den Diester BDNPP liegt dieses Gleichgewicht auf der Seite der aktiven, monodentat gebundenen Spezies, während der Monoester DNPP in der verbrückenden Koordination stabiler ist. Nach der Hydrolyse verbleibt das Produkt koordiniert am Komplex und verhindert eine katalytische Reaktion.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Comba, Prof. Dr. Peter
Date of thesis defense: 29 October 2010
Date Deposited: 12 Nov 2010 12:29
Date: 2010
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Saure Phosphatase, Tetraazacyclotetradecane, Koordinationslehre, Reaktionskinetik, Organische Synthese, Molekulardesign
Uncontrolled Keywords: MimetikaAcid Phosphatase , Mimetic , Coordination Chemistry , Molecular Modeling , Organic Synthesis
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