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Assembly, stability and regulation of flagellar motor in Escherichia coli

Li, Hui

German Title: Assemblierung, Stabilität und Regulation des Flagellenmotors in Escherichia coli

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Abstract

Bacterial flagellar motor is a highly ordered and complex supramolecular structure with two functions: it is both a rotary engine that powers the rotation of the flagella, coupling swimming to chemotactic signaling, and a type III protein export apparatus needed for assembly of extracellular flagella. Motor biogenesis represents a formidable example of self-assembly, involving a number of different proteins that form multiple oligomeric rings in the cytoplasm, periplasm and plasma membrane. Although late extracellular steps of the flagellar assembly process are comparatively well understood, much less is known about the early steps of the motor structure formation in the cytoplasm and in the plasma membrane. We used fluorescence imaging to dissect the order of the motor assembly in Escherichia coli cells and fluorescence resonance energy transfer (FRET) to map in vivo the underlying protein interactions. We observed that the self-association of the membrane export apparatus protein FlhA is independent of the other motor components, thus it is likely to be the first step in motor assembly. It is followed by the recruitment of the MS-ring component FliF and the ordered association of other motor structures with the association of each subsequent structure appearing to stabilize the growing assembly. We further applied fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) to show that parts of the assembled motor undergo dynamic protein exchange. In addition, we found an assembly-dependent stabilization of motor components against proteolytic degradation, indicating removal of the unassembled motor subunits through a protein quality control mechanism. Furthermore, we additionally demonstrated the involvement of DnaK/HtpG machinery in assembly of flagellar motor and chemosensory complexes and showed regulatory interactions between cyclic di-GMP binding protein YcgR and the stator component of flagellar motor MotA. Our results provide a novel and thus far the most comprehensive view of the early steps of flagellar motor assembly, enabling a better structural understanding of the flagellar export apparatus and other type III secretion systems. We believe that the observed combination of hierarchy and cooperativity in the assembly process could be common to many large intracellular complexes.

Translation of abstract (German)

Der bakterielle Flagellenmotor ist eine hochgeordnete und komplexe supramolekulare Struktur, die zwei Funktionen ausübt: Zum einen als rotierender Motor, der die Drehung der Flagellen antreibt und somit die Schwimmbewegung an die chemotaktische Wahrnehmung koppelt; Zum anderen als Typ III Proteinexportapparat, der zur Bildung der extrazellulären Flagellen benötigt wird. Die Biogenese des Motors ist ein eindrucksvolles Beispiel molekularer Selbstorganisation, bei der eine Vielzahl verschiedener Proteine mehrere oligomere Ringe in Zytoplasma, Periplasma und Plasmamembran bilden. Während die späten extrazellulären Schritte der Flagellenbildung vergleichsweise gut verstanden sind, ist über die frühen Schritte, die an der Bildung der Motorstrukturen im Zytoplasma und in der Plasmamembran beteiligt sind, nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie die Motor-Assemblierung in E. coli analysiert und mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) die zugrundeliegenden Proteininteraktionen in vivo untersucht. Die Analyse zeigte, dass FlhA, eine Komponente des Proteinexportapparats, die Fähigkeit besitzt, sich unabhängig von anderen Motorkomponenten spontan zusammenzulagern. Diese Zusammenlagerung stellt sehr wahrscheinlich den ersten Schritt in der Bildung des Motors dar, und ist gefolgt von einer Rekrutierung der MS-Ring Komponente FliF sowie der geordneten Anlagerung anderer Motorstrukturen, wobei die Assoziation jeder weiteren Struktur den wachsenden Komplex zu stabilisieren scheint. Darüber hinaus wurde durch Fluoreszenz Recovery After Photobleaching (FRAP) ein dynamischer Proteinaustausch in Teilen des funktionalen Motors nachgewiesen. Ferner konnte ein von der Reifung abhängiger Schutz der Motorkomponenten gegen proteolytischen Abbau festgestellt werden, was darauf hinweist, dass nicht eingebaute Untereinheiten durch einen Mechanismus der Proteinqualitätskontrolle entfernt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die DnaK/HtpG-Maschinerie sowohl an der Bildung des Flagellenmotors als auch an der Bildung chemosensorischer Komplexe beteiligt ist, und dass eine regulatorische Rolle zwischen YcgR, dem Bindeprotein von cyclischem di-GMP, und dem Stator-Protein MotA besteht. Die vorliegende Arbeit liefert einen neuen und den bisher vollständigsten Einblick in die frühen Schritte der Bildung des Flagellenmotors und ermöglicht ein besseres strukturelles Verständnis des Flagellen-Exportapparats und anderer Typ III Sekretionssysteme. Das beobachtete Zusammenspiel zwischen Hierarchie und Kooperativität im Bildungssprozess spielt vermutlich auch bei der Assemblierung von anderen großen intrazellulären Komplexen eine Rolle.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sourjik, Prof. Dr. Victor
Date of thesis defense: 10 November 2010
Date Deposited: 16 Nov 2010 11:25
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: FRET , FRAP , bacteria , secretion , flagella
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