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Functional studies on the galectin-4 promoter and its use for establishing a transcription factors array assay

Helwa, Reham

German Title: Funktionelle Untersuchungen zur Galectin-4-Promotor und dessen Verwendung für die Gründung einer Transkriptionsfaktoren Array Assay

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Abstract

In the present study, I profiled the expression pattern of different stages of six colorectal cancer and adenoma cell lines (SW1116, SW480, SW620, Co115, KM20L2, and LT97 in comparison to normal colon cell line CCD-18co). In our expression profiling data, we have found that galectin-4 was among the genes that are significantly upregulated in LT97 and KM20L2. We investigated galectin-4 upregulation as a signature of bad prognosis in colorectal cancer cell lines. In addition, we identified one possible mechanism of galectin-4 upregulation which is associated with a twin SNPs in the upstream sequence and the first intron. From the sequencing results of 115 patients, 26 out of the 115 (22.6%) were found to have the two SNPs together (ss217320370 and rs73933062), while the other patients did not carry any of these two SNPs. Therefore, we firstly showed that ss217320370 C>A at position 11572034 (a novel SNP was identified in the present study) and G>A at position 11571652 (rs73933062) are always together in the same individual (twin SNPs). Since the twin SNPs could potentially be associated with galectin-4 upregulation via deletion and insertion of new transcription factor binding sites, the twin SNPs may have medical impact in colorectal cancer patient. In parallel, another project was carried out to establish transcription factor protein. In conclusion, upregulation of galectin-4 was found to be associated with bad prognosis of colorectal cancer. In addition, two SNPs (ss217320370 and rs73933062) were found to be associated with galectin-4 upregulation, which might be referred to the changing in the binding sequence of the regulatory elements. Using galectin-4 promoter with the twin SNPs was useful in setting up TFs-array to detect DNA-protein interactions, since the microarray result was concordant with pull down-mass spectrometry analysis of galectin-4 promoter.

Translation of abstract (German)

Kolorektales Karzinom (CRC) gehört zu einer der meist häufigsten Krebsart bei Männern und Frauen und zählt jedes Jahr zu 10% aller neuen Krebsfälle und Krebs-bedingten Todesfällen. Galectin-4 wird in gastrointestinalen Geweben exprimiert und nicht in Niere, Hirn, Skelettmuskulatur, Herz, Leber oder Lunge. Ziel dieser Arbeit war es, Kandidatengene für die Prognose von kolorektalem Krebs zu finden und deren Regulation zu untersuchen. Ein weiteres Ziel war die Etablierung eines Protein-Microarrays, um die DNA-Protein-Interaktion unter Verwendung des Gal-4 Promoters zu erforschen. In der vorliegenden Studie habe ich das Expressionsmuster von sechs verschiedenen Stadien von kolorektalem Karzinom und Adenoma Zelllinien (SW1116, SW480, SW620, Co115, KM20L2 und LT97) im Vergleich zur normalen kolorektalen Zellinie CCD-18co profiliert. In den Expressionsprofilierungsdaten fanden wir Galectin-4 unter denjenigen Genen, die signifikant in LT97 und KM20L2 hoch reguliert waren. Wir stellten die Hochregulation von Galectin-4 in kolorektalen Krebszelllinien als ein Zeichen für schlechte Prognose fest. Außerdem identifizierten wir einen möglichen Mechanismus der Hochregulation von Galectin-4 mit einem assoziierten „Zwillings-SNP“ in der upstream Sequenz und dem ersten Intron. Von 115 Patienten-Sequenzierergebnissen wurden in 26 Patienten (22,6%) die zwei SNPs (ss217320370 und rs73933062) gefunden. Wir haben zunächst gezeigt, dass ss217320370 C>A an der Position 11572034 (ein neues SNP wurde in der vorliegenden Studie identifiziert) und G>A an der Position 11571652 (rs73933062) immer im gleichen Individuum vorkommen („Zwillings-SNP“). Da diese Zwillings-SNPs mit der Hochregulation von Galectin-4 via Deletion und Insertion von neuen Transkriptionsfaktoren Bindestellen assoziiert sind, könnten die Zwillings-SNPs eine mögliche medizinischen Auswirkung bei Patienten mit kolorektalem Krebs haben. Parallel wurde ein weiteres Projekt durchgeführt, um einen Transkriptionsfaktor-Array für die Detektion von DNA-Protein Interaktion zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden 50 Transkriptionsfaktoren (TF)-Proteine exprimiert und aufgereinigt. Daraufhin wurde eine Epoxy-Oberfläche optimiert, um die TF-Proteine bei 37°C übernacht zu immobilisieren. Die DNA-Protein Interaktion wurde auf dem Array optimiert unter Verwendung von kurzen Polynukleotid Sequenzen aus der TransFac Datenbank und PCR-Produkten des Galectin-4 VI Promoters. Unter Verwendung des Galectin-4 Promoters und deren SNPs wurden geeignete Bedingungen für DNA und Proteine auf der Microarray Oberfläche etabliert. Interessanterweise waren die Ergebnisse der Pull-down-Massen Spektrometrie Ergebnisse kompatibel mit denen der Transkriptionsfaktoren-Arrays. Schließlich wurde eine Hochregulation von Gal-4 assoziiert mit einer schlechten Prognose von kolorektalem Krebs gefunden. Außerdem wurde heraus gefunden, dass zwei SNPs (ss217320370 und rs73933062) mit der Gal-4 Hochregulation assoziiert sind, was der Veränderung in der Bindesequenz des regulatorischen Elements zugeschrieben werden könnte. Die Verwendung des Galectin-4 Promoters mit den Zwillings-SNPs war nützlich, um einen Transkriptionfaktor-Array für die Detektion von DNA-Protein Interaktionen einzurichten, da die Microarray-Ergebnisse einstimmig mit den Pull-down Massenspektrometrie Analysen des Galectin-4 Promoters waren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wiemann, Dr. PD Stefan
Date of thesis defense: 1 December 2010
Date Deposited: 07 Dec 2010 08:46
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: galectin-4 , colorectal cancer , transcription factor-array , DNA-protein interaction
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