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Diagnostik von invasiven Aspergillusinfektionen aus klinischen Materialien durch fluoreszenzspektroskopische und massenspektrometrische Methoden

Neustadt, Madlen

English Title: Diagnosis of invasive infections caused by aspergillus species from clinical material by fluorescence spectroscopic and mass spectrometric methods

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Abstract

Aspergillus-Spezies sind ubiquitär vorkommende Schimmelpilze. Bei immunsupprimierten Patienten wie Leukämie- und Transplantationspatienten verursachen Aspergillus-Spezies opportunistische Infektionen mit häufig letalem Ausgang. Die Diagnostik dieser Erkrankung beschränkt sich aktuell auf einen Aspergillus-Antigennachweis, molekularbiologische Diagnosemethoden und bildgebende Verfahren. Alle Methoden haben allerdings eine jeweils ungenügende diagnostische Sensitivität und/oder Spezifität. Zudem sind molekularbiologische Nachweismethoden durchgängig sehr aufwändige Verfahren mit noch mangelnder Standardisierung und daher in der Verbreitung auf wenige spezialisierte Laboratorien beschränkt. Ziel des durch die Deutsche José-Carreras-Leukämiestiftung geförderten Projektes war die Entwicklung und Validierung einer neuen, massenspektrometrie-basierten Diagnosestrategie, welche die Früherkennung von invasiven Aspergillus-Infektionen aus Serumproben von Hochrisikopatienten mit verbesserter diagnostischer Sensitivität und Spezifität ermöglichen soll. Der unmittelbare diagnostische Einsatz von massenspektrometrie-basierten Profiling-Untersuchungen ist aufgrund hoher präanalytischer Varianz und großer Abundanzunterschiede in der Proteinzusammensetzung von klinischem Probenmaterial bisher nicht möglich. Durch Reporter-Peptid-Spiking (RPS) können bisherige Limitierungen des MS-basierten Profiling überwunden werden. Grundlage des zu entwickelnden Verfahrens ist die Spaltung von Peptidsubstraten durch krankheitsassoziierte Proteasen in einer klinischen Probe wie etwa Serum. Proteasen spielen bei der Pathogenese vieler Erkrankungen, spezifisch auch bei der Entwicklung einer invasiven Aspergillose, eine entscheidende Rolle. Die sezernierten Proteasen des Aspergillus fumigatus wurden während dieser Arbeit direkt durch massenspektrometrische Proteomanalyse und indirekt durch funktionelle Untersuchungen charakterisiert. Für die direkte Charakterisierung der Proteasen wurde der Kulturüberstand mittels trägerloser Elektrophorese (FFE) getrennt. Anschließend wurde die Proteaseaktivität in den erhaltenen Fraktionen mit fluoreszenzmarkierten Peptiden bestimmt. Die höchste Proteaseaktivität wurde in Fraktionen des sauren pH-Bereiches detektiert. Parallel dazu wurden die Assays mit verschiedenen Proteaseinhibitoren durchgeführt. Die Ergebnisse des Inhibierungsmusters wiesen deutlich darauf hin, dass vorwiegend Metallo- und Serinproteasen die verwendeten Peptide abbauen. Die Fraktionen wurden einem tryptischen Verdau unterzogen und per LC-MS/MS Analyse untersucht. Die Identifizierung der im Kulturüberstand enthaltenen Proteine resultierte in der Detektion von vier Proteasen unter zahlreichen anderen Aspergillus-spezifischen Proteinen und Enzymen. Die systematische Substratsuche begann in silico in Substratbibliotheken wie Merops und Publikationen. Aus einer Vielzahl von synthetisierten Peptidsubstraten konnten fünf Substrate selektiert und für einen Proteaseassay mit massenspektrometrischer Detektion etabliert werden. Diese Substrate wurden spezifisch durch Aspergillus fumigatus abgebaut. Die Peptidfragmente wurden nach der Inkubation seriell mittels Affinitätschromatografie aufgereinigt und mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer gemessen. Der Assay wurde in einer umfangreichen Studie mit Patientenproben angewendet. Dabei wurden Proben von gesicherten Aspergillose-Fällen verwendet, sowie weitere Proben von Hochrisikopatienten. Die Sensitivität bzw. Spezifität des Assays betrug 41-81% bzw. 57-85% und war damit dem konventionellen Galaktomannan-Test in Bezug auf die Sensitivität für die verwendeten Modelle überlegen (27 bzw. 36% Sensitivität). Das Methodenprinzip ("proof-of-principle") konnte mit den Messungen bewiesen werden. Dennoch gilt es die Spezifität und Sensitivität zu verbessern, wie z. B. durch den Einsatz von komplexen randomisiertem Peptidbibliotheken oder durch weitere Modifikationen an den Schnittstellen der Peptide. Daraus kann dann ein Reporterpeptidmix aus mehreren Substraten (Multiplex-Ansatz) als Screening genutzt werden. Alternativ zur Massenspektrometrie wurde mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie versucht, ein weiteres Testsystem zur Signaldetektion von Proteaseaktivität zu etablieren. Dazu wurde ein Substrat aus den benutzten fünf massenspektrometrischen Substraten ausgewählt, und für diese Methode modifiziert. Eine Differenzierung durch den Diffusionskoeffizienten war nur bedingt möglich. Durch weitere Optimierung des Reporterpeptidformates und dem Einsatz von Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie sollte es möglich sein, die diagnostische Leistungsfähigkeit des funktionellen Protease Profilings weiter zu verbessern.

Translation of abstract (English)

Aspergillus species are ubiquitous saprophytic fungi. Immunsupprimised patients like leukemia- and transplantation patients Aspergillus species causes opportunistic infections with fatal outcome. Early diagnosis of life-threatening invasive aspergillosis (IA) in neutropenic patients remains challenging because current laboratory methods like Aspergillus-antigen detection, molecular biology methods or imaging have limited diagnostic sensitivity and/or specificity. Novel molecular detection is promising, but a routine examination has not been established yet, because of their complex procedure. The aim of this project was the development and validation of a new method based on mass spectrometry for early diagnosis with improved sensitivity and specificity. Directly mass spectrometry based profiling investigations are not possible because the clinical sample material differs too much in its abundance of the protein composition and their high preanalytical variance. The previous limitation of mass spectrometry based profiling can be resolved by Reporter-Peptid-Spiking (RPS). The technique bases on the cleavage of small peptides by disease-associated proteases in clinical samples like serum. Proteases play a major role during pathogenesis of several diseases such as invasive Aspergillosis. During this work the proteases secreted by Aspergillus fumigatus were detected directly by mass spectrometric proteome analysis and indirectly by a functional assay. For the direct characterization and identification of secreted proteases, the culture supernatant of Aspergillus fumigatus was fractionated using Free Flow Electrophoresis (Becton Dickinson). Protease activity of separated fractions was measured using fluorescently-labeled reporter peptides. Fractions were also co-incubated in parallel with various protease inhibitors. Those fractions with high protease activity were further subjected to LC-MS/MS analysis for protease identification. The highest protease activity was measured in fractions with an acidic pH range. The results of the 'inhibitor-panel' gave a clear indication, that mainly metallo- and serine-proteases are involved in the degradation of reporter peptides. All fractions were digested with Trypsin and analyzed with LC-MS/MS. Furthermore four proteases could be identified among numerous Aspergillus specific proteins and enzymes. The systematic search for substrates from peptide libraries began with a review of Merops data base and papers and ended with the establishment of an mass spectrometric assay with five peptides, which cleaved by Aspergillus fumigatus specifically. The sample preparation was carried out by a two step protocol and measured with a MALDI-TOF mass spectrometer. A clinical trial was performed with samples of patients with the five substrates assay. Samples which presents proven Aspergillosis cases as well as samples of high risk patients were used. The sensitivity of the assay was found between 41-81% and the specificity between 53-85%. The conventionel Galactomannan assay was less sensitive in the used models (27 and 36% sensitivity). The "proof-of-principle" was demonstrated. However diagnostic specificity and sensitivity have to be improved for instance with the application of extensive and randomized libraries of peptides. After improvement the reporter-peptide-mix with different substrates can be used as disease classification (multiplexing approach). The third part of this work was an attempt to establish another protease assay with fluorescence correlation spectroscopy alternatively to mass spectrometry. One peptide of the previous mass spectrometric substrates was chosen and modified with fluorophores. A differentiation by the determination of diffusion coefficients was not successful because of similar peptide fragments in the samples. The reporter peptide has to be optimized. Additionally the application of fluorescence cross correlation spectroscopy should improve the assay to avoid the enormous calculation efforts.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Prof. Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 12. November 2010
Date Deposited: 20. Jan 2011 10:58
Date: 2010
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Institut für Klinische Chemie
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Aspergillus, Aspergillus fumigatus, MALDI-MS, invasive Aspergillose
Uncontrolled Keywords: Aspergillus fumigatus , MALDI-MS, invasive Aspergillosis
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