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Spatio-temporäre Analyse des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors : Modulation der Signaltransduktion durch das humane Papillomavirus Typ 16 E5-Protein

Reinz, Eileen

English Title: Spatio-temporal analysis of the epidermal growth factor receptor : modulation of signaltransduction by the human papillomavirus typ 16 E5 protein

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PDF, German
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Abstract

Ursächlich für die Entstehung eines Zervixkarzinoms ist eine persistierende Infektion mit humanpathogenen Papillomaviren (HPV) des sogenannten Hochrisiko-Typs, deren DNA-Sequenzen in mehr als 65% aller Zervixkarzinome nachgewiesen werden konnten. Die HPV-Familie besteht aus mehr als 100 Typen, von denen vorwiegend die Typen 16 und 18 mit der tumoralen Entwicklung assoziiert sind. Verantwortlich für die Malignisierung des Epithels sind drei Onkogene des HPV-Typs 16, dazu zählt das kleine, hydrophobe Protein E5, welches hauptsächlich in der Membran von Golgi-Apparat und endosomaler Kompartimente lokalisiert ist. Das Protein besitzt selbst nur schwache transformierende Eigenschaften, ist aber in der Lage die Onkogenizität der beiden anderen Onkogene E6 und E7 zu potenzieren. Der Haupteffekt des E5-Onkogens ist eine Überaktivierung des EGF-Rezeptors (EGFR), deren Folge eine gesteigerte Transkription mit anschließender Mitose ist. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der zellbiologischen Mechanismen, die durch E5 moduliert werden und eine verstärkte Aktivierung der EGF-Rezeptoren bewirken. Die quantitative Analyse mittels Immunblot und On-Cell Western Blot zeigte in Anwesenheit von HPV16 E5 eine Zunahme an Oberflächen-assoziierten EGF-Rezeptoren. Folglich wurde im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine Verstärkung der Liganden-vermittelten EGFR-Aktivierung hervorgerufen, die über einen langen Zeitraum nach Zugabe von EGF anhielt und unabhängig von der Internalisierungsrate war. Zusätzlich zu den klassischen molekular- und zellbiologischen Methoden wurde eine neue Technologie eingesetzt, die eine spatio-temporäre Analyse der E5-bedingten Modulation der EGFR-Signaltransduktion ermöglichte. Mit Hilfe der automatisierten, quantitativen Analyse von drei-dimensionalen Multikanalbildern, die am konfokalen Mikroskop generiert wurden, konnte eine genaue Charakterisierung des endozytotischen Transports von aktivierten und Gesamt-EGFR in Leervektor- und E5-transduzierten Zellen erfolgen. Der Einsatz von Vesikel-spezifischen Markern ermöglichte zudem die genaue Lokalisation der Rezeptoren innerhalb eines spezifischen zellulären Kompartiments. In Anwesenheit von E5 konnte eine stärkere und schnellere Fusion von EGFR-positiven Vesikeln mit dem frühen Endosomen nachgewiesen werden. Durch das zügige Fortschreiten des endozytotischen Transports erreichte eine deutliche höhere Anzahl von phospho-EGFR-positiven Vesikeln frühzeitig die perinuklear lokalisierten multivesikulären Körperchen (MVB), ohne zuvor die zytoplasmatischen MVBs zu passieren. Zu den späten Zeitpunkten der EGF-Stimulation konnte eine Akkumulation von aktivierten Rezeptoren in perinuklearen Endosomen-ähnlichen Kompartimenten heterogener Struktur dokumentiert werden, die mit einer verminderten Dephosphorylierung von aktivierten Rezeptoren verbunden war und schließlich zu einer langanhaltenden Überaktivierung von EGF-Rezeptoren führte. Durch die Behandlung mit dem Recycling-Inhibitor Monensin konnte im Vergleich zu den Kontrollen keine Beeinträchtigung der Phosphorylierung von EGFR in E5-exprimierenden Zellen dokumentiert werden. Damit kann eine potentielle Zunahme des Recyclings von EGF-Rezeptoren als Ursache der E5-vermittelten Überaktivierung ausgeschlossen werden. Die hier dargestellten Ergebnisse beweisen, dass die verstärkte und langanhaltende Aktivierung von EGFR durch eine modifizierte Endozytose und Dephosphorylierung während des Transports der Rezeptoren von frühen Endosomen zu den multivesikulären Körperchen verursacht wird. Dadurch umgehen die Rezeptoren den Abbau in den Lysosomen und bewirken eine gesteigerte Transkription früher Gene im Nukleus, die in einer EGFR-vermittelten Deregulation der Zellproliferation, -differenzierung und Apoptose resultiert.

Translation of abstract (English)

The persistent infection by human papillomavirus (HPV) of mainly types 16 and 18 is the initial step for cervical cancer development, but additional genetic alterations are required for the progression to cervical carcinomas. The three HPV oncogenes E5, E6 and E7 are known to play a major role in cervical carcinogenesis causing deregulation of cell differentiation, proliferation and apoptosis and providing infected cells with a selective growth advantage. The small hydrophobic protein E5, largely located in the membranes of the Golgi apparatus and endosomal compartments, is characterized by weak transforming activity, but able to potentiate the oncogenic effects of E6 and E7. Main target of the E5 protein has been found to be the epidermal growth factor receptor (EGFR). It has been suggested that E5 causes a downregulation of EGFR ubiquitination and degradation leading to upregulation of its kinase activity. Aim of the present work was the characterization of the molecular mechanisms that are modulated by E5 leading to EGFR overactivation. Quantitative Immunblot analyses and On-Cell Western Blot analyses were performed to establish relative levels of surface, activated and total EGFR in E5-expressing human keratinocytes and in the corresponding controls. Upon EGF stimulation we observed in E5-expressing cells an upregulation of plasma membrane-associated receptors. The ligand-mediated overactivation lasted longer in cells expressing the viral gene compared to controls and was independent of the internalization ratio. In order to study the behavior of the receptors during trafficking, a novel technical approach of image analysis allowing spatio-temporal investigation of the E5-modulated EGFR-signaling was employed. This approach is based on the quantitative analysis of 3D pictures obtained by confocal microscopy simultaneously using antibodies specific for the receptor, total or phosphorylated, and for different cellular compartments. With this methodology we were able to depict a spatio-temporal picture of the receptor fate in control and E5-expressing cells. In the presence of E5 we detected a faster and stronger fusion of EGFR-positive vesicles with early endosomes, vesicles which were rapidly transported to multivesicular bodies. Further, in E5-expressing cells we found an accumulation of the receptor in perinuclear endosomal-like compartments of heterogeneous structure. Further, we could demonstrate that E5-mediated EGFR overactivation was not affected in the presence of tyrosine kinase inhibitors. In addition, no changes were noticed in the recycling pattern of the receptors when trafficking was chemically suppressed. All these results indicate that HPV16 E5 modulates receptor trafficking and not, as has been currently accepted, receptor recycling. The impaired trafficking leads to a decreased receptor dephosphorylation and a long-lasting downstream signaling. The consequence is an increased transport of transcriptional factors to the nucleus resulting in altered gene expression and deregulated cell proliferation.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Müller, Dr. PD Martin
Date of thesis defense: 7 February 2011
Date Deposited: 17 Feb 2011 08:39
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor, Humanes Papillomavirus, Signaltransduktion
Uncontrolled Keywords: E5 , ZervixkarzinomHPV , E5 , EGFR , cervical cancer
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