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Signal transduction of the atypical GTPase RhoH in Interleukin-3 dependent cell systems

Gündogdu, Mehtap Selda

German Title: Signaltransduktion der atypischen GTPase RhoH in Interleukin-3 abhängigen Zellsystemen

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Abstract

The hematopoietic, atypical GTPase RhoH is reported to function as a negative regulator of progenitor cell differentiation, proliferation and survival. IL-3 is an important cytokine, signalling mainly via the JAK-STAT pathway and by this promoting hematopoiesis, progenitor cell survival and differentiation of myeloid cells, such as mast cells. This study aimed to investigate the role of RhoH and important components in the signalling network of RhoH in IL-3 mediated signal transduction. It was attempted to link published, as well as the gained, information of this study to profile hematopoietic malignancies with aberrant RhoH expression. Finally, complementary studies were performed with in vitro IL-3 derived mast cells to address the role of RhoH in IL-3 mediated cell differentiation and its function in mast cell mediated processes, such as anaphylaxis. RhoH overexpression in BaF3 cells resulted in inhibition of IL-3 induced proliferation correlating with increased STAT1 and decreased STAT5 activity. Downregulation of RhoH was followed by an increase in IL-3 proliferation associated with enhanced STAT5 phosphorylation. Altered STAT1 activation induced increased expression of the cell cycle inhibitors (CDKIs) p21waf/cip and p27kip. Enforced IL-3 induced STAT5 activation in cells with low RhoH expression led to enhanced sensitivity of cells to IL-3, as a result of an upregulation of the STAT5 dependent transcription factor IRF-1 which induced increased IL-3 alpha chain (CD123) surface expression. RhoH expression was tested in lymphoma cell lines which were characterised based on their immunophenotype, STAT and GTPase activity. RhoH was strongly underexpressed in almost every cell line, suggesting that RhoH plays an important role in the formation of hematopoietic cancer types. To gain further insight into the IL-3 dependent signalling networks of RhoH, cytokine treatment dependent proteomic experimebyents were performed with IL-3 dependent BaF3 cells. A cytokine dependent pattern of protein interactions was identified. The interaction with RhoH was verified in HEK cells for two proteins: Cofilin-1 and PTP1B. Both of these proteins were found to have effects that can be related to the previous findings of this study in IL-3 mediated signalling. Finally, experiments in mast cells were performed to identify the role of RhoH for IL-3 dependent cell differentiation and function, indicating that RhoH deficiency does not affect the IL-3 induced differentiation. However, the loss of RhoH has functional consequences on mast cell biology, such as decreased cytokine production and mast cell mediator release. These findings link RhoH expression and RhoH modulated IL-3 induced proliferation on the one hand to STAT1 dependent induction of CDKIs and on the other hand to the increased STAT5 dependent CD123 expression. It is suggested that RhoH is a tandem regulator of IL-3 dependent STAT5/STAT1 activation, most likely by newly discovered interactions with key signalling proteins such as PTP1B and Cofilin-1. Altered RhoH expression pattern in different hematopoietic disorders also suggests that the identified role of RhoH in IL-3 dependent signalling is transferrable to aberrant signalling in cancerogenous diseases. Furthermore, it was postulated that, although RhoH is dispensable for IL-3 mediated myeloid mast cell differentiation, the lack of RhoH has serious impact on mast cell mediated effects.

Translation of abstract (German)

Die hämatopoetische GTPase RhoH ist ein negativer Regulator für die Vorläuferzelldifferenzierung, Proliferation sowie für das Überleben hämatopoetischer Stammzellen. Die Regulation der Differenzierung und des Überlebens dieser Zellen erfolgt hauptsächlich über den IL-3 abhängigen JAK-STAT Signalweg. Ziel dieser Studie war es die Rolle von RhoH in der IL-3 abhängigen Signaltransduktion zu untersuchen und neue Komponenten der RhoH vermittelten Signaltransduktion zu identifizieren. Zusätzlich wurde anhand von Hinweisen aus der Literatur verschiedene Lypmhoma Zellinien hinsichtlich ihrer RhoH Expression im Zusammenhang mit der Aggressivität der jeweiligen Tumorzellen analysiert. Ausserdem sollte der Einfluss von RhoH auf die IL-3 abhängige Mastzelldifferenzierung und deren Funktion (z.B. Anaphylaxie) mittels in vitro generierter Mastzellen geklärt werden. Die Überexpression von RhoH in der murinen Pro-B-Zelllinie Baf3 korrelierte mit der Inhibition IL-3 vermittelter Proliferation einhergehend mit einer erhöhten STAT1 und verminderter STAT5 Phosphorylierung. Umgekehrt führte die Inhibition der RhoH Expression zu einer verstärkten IL-3 vermittelten Proliferation, verbunden mit einer erhöhten STAT5 Phosphorylierung. Die verstärkte STAT1 Aktivität induzierte eine erhöhte Expression der Zell Zyklus Inhibitoren (CDKIs) p21waf/cip1 und p27kip1 in RhoH überexprimierenden Zellen, während die erhöhte STAT5 Aktivierung in RhoH defizienten Zellen in einer gesteigerten Expression des STAT5 abhängigen Transkriptionsfaktors IRF-1 resultierte. Dies führt wiederum zur Überexpression der IL-3  Kette CD123 an der Zelloberfläche. Verringerte RhoH Expression konnte in verschiedenen Lymphoma Zelllinien nachgewiesen werden, die aufgrund ihres Immunophentoyps sowie ihrer veränderten STAT und GTPase Aktivitäten ausgewählt wurden. In verschiedenen RhoH Proteomanalysen wurden Zytokin abhängige Bindungsmuster mit RhoH interagierenden Proteinen festgestellt. Es konnten Interaktionen von RhoH mit Cofilin-1 und PTP1B in HEK Zellen nachgewiesen werden. Diese beiden Proteine können potentiell an den in dieser Studie gefundenen RhoH abhängigen Modulationen im IL-3 abhängigen Signalweg beteiligt sein. Abschließend konnte in Mastzellen gezeigt werden, dass RhoH keinen Einfluss auf die IL-3 vermittelte Zelldifferenzierung nimmt. Der Verlust von RhoH hatte jedoch schwerwiegende funktionelle Konsequenzen in den Mastzellen, wie eine verminderte Zytokin- und Histaminsekretion. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass RhoH die IL-3 vermittelte Signaltransduktion und vor allem die IL-3 abhängige Proliferation beeinflusst. Dies geschieht zum einen durch eine Modulation der STAT1 Aktivität und der Expression von STAT1 abhängigen CDKIs und zum anderen durch die Veränderung der STAT5/IRF-1 abhängigen CD123 Expression. RhoH wird eine Rolle als Tandem-Regulator in der IL-3 induzierten STAT5/STAT1 Aktivität zugeschrieben, die wahrscheinlich durch die Interaktion mit den Proteinen PTP1B und Cofilin-1 zustande kommt. Anhand der nachgewiesenen Expressionmuster von RhoH in Lymphoma Zellinien wird angenommen, dass RhoH eine wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung als auch in deren Verlauf spielt. Für Mastzellen konnte gezeigt werden, dass RhoH keinen Einfluss auf die IL-3 abhängige Zelldifferenzierung nimmt jedoch die Expression von RhoH essentiell für die vermittelten Zellfunktionen ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Lanzer, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 3. February 2011
Date Deposited: 28. Feb 2011 11:51
Date: 2011
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Cytokine, Guanosintriphosphatasen, Mastzelle, Interleukin 3, Hämatopoese, Proliferation, Histamin
Uncontrolled Keywords: RhoH , atypische GTPase , CD123RhoH , atypical GTPase , CD123
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