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Genome integration structures and genotype variants of oncogenic human papillomavirus types HPV16 and HPV68 in cervical carcinoma-derived cell lines, cervical precursor lesions and carcinomas

Chotewutmontri, Sasithorn

German Title: Genomintegration und Genotypvariante von onkogenischen humanen Papillomviren Type HPV16 und HPV68 in Zervixkarzinom-Zelllinien, Zervix-Krebsvorstufen und Karzinomen

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Abstract

Persistent infection with high-risk human papillomavirus (hr-HPV) is essential for cervical carcinogenesis, and is frequently followed by integration of the viral DNA into the host genome. Upon integration, the viral E2 gene is usually disrupted or deleted leading to deregulated transcription of the E6/E7 oncogenes from the upstream regulatory region (URR). Integrated HPV DNA may also affect critical cellular genes through insertional mutagenesis, which can contribute to the multi-step process of cervical carcinogenesis. HPV16 is the most frequent and HPV68 is a rare hr-HPV type, present in about 55% and less than 1% of cervical carcinomas worldwide, respectively. In this work, HPV68 DNA structures in cervical carcinoma cell lines and clinical samples were analyzed. HPV16 integration and E1-E2 sequences were studied using the novel “amplification selection pyrosequencing of HPV16” (ASP16) strategy. HPV68 is divided into two subtypes, a and b. A hallmark of HPV68b is its presence as integrated DNA in the cervical carcinoma cell line ME180. In the mutant cell line ME180R, selected for resistance to growth inhibition by tumor-necrosis-factor alpha (TNFalpha), partial deletions in the integrated HPV68b DNA had been detected. In this study, the complete structures of the integrated HPV68b in ME180 and ME180R have been determined. ME180 cells contain two disrupted HPV68b copies, integrated in a unique head-to-head arrangement into chromosome 18q21. By selection of new TNFalpha-resistant ME180 sub-lines, it was found that the rearrangements and partial deletions of HPV68b in ME180R are unnecessary for the TNFalpha-resistance phenotype. In addition, a full-length and a mutant HPV68b genome were isolated from a cervical intraepithelial neoplasia grade 2 (CIN2) precursor lesion, cloned and completely sequenced. The mutant genome carrying a 1.2-kb deletion in the E1 gene is probably integrated. Based on partial URR sequences, ten HPV68b variants, nine of them new, and one HPV68a variant have been identified in eleven clinical samples, suggesting that HPV68b is more widely distributed than HPV68a and is present in a multitude of molecular variants. ASP16 was developed for simultaneous determination of HPV16 integration junctions in multiple clinical DNA samples. It consists of four main steps: GenomePlex whole genome amplification, HPV16 E1-E2 sequence enrichment, Roche/454 GS-FLX pyrosequencing, and data analysis. In this work, computer programs for ASP16 data analysis were developed and applied. The ASP16 strategy was further optimized and used for the analysis of 25 HPV16-positive samples. The optimized ASP16 delivered longer sequence read lengths and 89% average sequence coverage. HPV16 integration junctions were identified in 3 out of 4 cell lines, and 6 out of 21 clinical samples. The HPV16 integration sites identified in the clinical samples are all located near cellular proto-oncogenes or tumor suppressor genes, supporting the assumption that HPV integration contributes to cervical carcinogenesis by altering cancer-relevant cellular genes. The high E1-E2 sequence coverage also allowed HPV16 variant assignments. Altogether, the ASP16 strategy, which is the first method combining next generation sequencing technologies with HPV integration analysis in a multiplex format, shows the potential to identify HPV16 integration junctions in series of clinical samples in parallel and at the same time provides E1-E2 sequences suitable for mutation/variant analysis.

Translation of abstract (German)

Für die Entstehung von Gebärmutterhalskrebs (Zervixkarzinom) ist eine persistierende Infektion mit humanen Papillomviren (HPV) der Hochrisiko-Gruppe die entscheidende Voraussetzung. Häufig erfolgt später eine Integration der viralen DNA in das Genom der Wirtszellen. Durch die Integration wird meistens das virale E2-Gen zerstört oder deletiert, wodurch es zur Deregulation der in der „upstream regulatory region“ (URR) gestarteten Transkription der viralen Onkogene E6 und E7 kommt. Einen zusätzlichen Einfluss auf den Mehrstufenprozess der Zervixkarzinogenese kann die integrierte HPV-DNA ausüben, indem wichtige zelluläre Gene durch Insertionsmutagenese verändert werden. HPV16 ist der häufigste und HPV68 ein seltener Hochrisiko-HPV-Typ. HPV16 kommt in ungefähr 55 % der weltweit untersuchten Zervixkarzinome vor, HPV68 in weniger als 1 %. In dieser Arbeit wurden in Zervixkarzinom-Zelllinien und in klinischen Proben von Zervixabstrichen die DNA-Strukturen von HPV68 bestimmt sowie HPV16- Integration und Sequenzen des E1-E2-Genbereichs mittels der neuen ASP16-Strategie („amplification selection pyrosequencing of HPV16“) analysiert. HPV68 wird in zwei Subtypen, a und b, unterteilt. Besonderes Merkmal von HPV68b ist das Vorkommen als integrierte DNA in der Zervixkarzinom-Zelllinie ME180. Die davon abgeleitete Linie ME180R, resistent gegenüber Wachstumsinhibition durch Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFalpha), weist partielle Deletionen in der integrierten HPV68b-DNA auf. In dieser Arbeit wurden die kompletten Strukturen der integrierten HPV68b-DNA in ME180 und ME180R bestimmt. ME180-Zellen enthalten zwei unvollständige Kopien von HPV68b, die in einer einzigartigen Kopf-Kopf-Anordnung integriert vorliegen. Durch Selektion von zwei neuen TNFalpha-resistenten ME180-Sublinien konnte gezeigt werden, dass die Umlagerungen und partiellen Deletionen der integrierten HPV68b-DNA in ME180R nicht wesentlich für den TNFalpha-resistenten Phänotyp sind. Aus einer CIN2-Krebsvorstufe (zervikale intraepitheliale Neoplasie Grad 2) wurden ein komplettes und ein mutiertes HPV68b-Genom isoliert, kloniert und sequenziert. Das mutierte Genom, das eine 1,2 kb große Deletion im E1-Gen aufweist, liegt wahrscheinlich integriert vor. In elf HPV68-positiven klinischen Proben wurde das virale Genom durch partielle URRSequenzierung untersucht. Eine Probe enthielt HPV68a, die anderen zehn Proben enthielten HPV68b- Varianten, von denen neun vorher unbekannt waren. Die Ergebnisse zeigen, dass HPV68b häufiger als HPV68a und in vielen molekularen Varianten vorkommt. Die ASP16-Strategie wurde entwickelt zur gleichzeitigen Bestimmung von HPV16-Integrationsstellen in einer Vielzahl von klinischen DNA-Proben. ASP16 besteht aus vier Hauptschritten: GenomePlex Gesamtgenom-Amplifikation, Anreicherung von HPV16 E1-E2-Sequenzen, Roche/454 GS-FLX Pyrosequenzierung, und Daten-Analyse. In dieser Arbeit wurden Computerprogramme zur ASP16- Datenanalyse entwickelt und eingesetzt. Die ASP16-Strategie wurde weiter optimiert und zur Analyse von 25 HPV16-positiven Proben eingesetzt. Es wurden längere Einzelsequenzen als vorher sowie eine Sequenzabdeckung von 89 % erreicht. HPV16-Integrationsstellen konnten in 3 von 4 Zelllinien und in 6 von 21 klinischen Proben identifiziert werden. Die in den klinischen Proben identifizierten HPV16- Integrationsstellen liegen alle in oder in der Nähe von zellulären Proto-Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen. Diese Befunde unterstützen die Vermutung, dass die HPV-Integration durch Veränderungen krebsrelevanter zellulärer Gene zur Zervixkarzinogenese beitragen kann. Die hohe Sequenzabdeckung im E1-E2-Bereich ermöglichte auch die Bestimmung von HPV16-Varianten. Die ASP16-Strategie ist die erste Methode, die „next generation sequencing“-Technologien mit der Bestimmung von HPV-Integrationsstellen im Multiplex-Format kombiniert. ASP16 ermöglicht damit die serienmäßige Analyse von HPV16-Integrationsstellen in klinischen Proben und liefert gleichzeitig E1-E2- Sequenzen zur Bestimmung von Mutationen und Varianten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schwarz, Prof. Dr. Elisabeth
Date of thesis defense: 16 February 2011
Date Deposited: 17 Feb 2011 14:21
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: HPV16 , HPV68 , DNA Integration , Cervical cancer
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