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Analyses of small Rho-GTPases signaling molecules during vertebrate development and angiogenesis

Dietz, Christian Tobias

German Title: Analyse von kleinen Rho-GTPase Signalmolekülen während der Vertebratenentwicklung und der Angiogenese

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Abstract

The members of the Rho family of small GTPases were originally identified to be involved in a variety of cellular processes, including regulation of F-actin cytoskeleton and microtubule dynamics, cell polarity, vesicle transport and gene expression. In recent studies G-proteins have been implicated to function as key modulators of angiogenesis. G-protein signaling is thereby strongly associated with angiogenic processes, such as the regulation of vascular permeability, remodeling of the extracellular matrix, endothelial migration, proliferation, morphogenesis, and survival. Much of our knowledge regarding G-protein signaling was hitherto predominantly obtained by in vitro experiments or by in vivo studies performed in invertebrates. However, little is known about their regulation and function in vertebrates. Thus, this thesis was aimed at uncovering the role of selected G-proteins during vertebrate development with the focus on angiogenesis. Recently, the guanine nucleotide exchange factor (GEF) Ect-2 interacting BTB-kelch protein KLEIP (KLHL20) was implicated in angiogenesis as a novel and essential regulator of endothelial function that controls the VEGF-induced activation of the small GTPase RhoA. In order to unravel Kleip’s function during angiogenesis in vivo, as well as during development, the Kleip gene was disrupted in mice. Constitutive inactivation of Kleip accomplished by gene-trapping led to a partially lethal phenotype. Some Kleip-deficient embryos died between midgestation and birth due to cranial hemorrhages. This dysfunction in maintaining vascular integrity was furthermore supported by studies with splice-blocking morpholino-induced downregulation of klhl20 in zebrafish embryos as well as by an in vitro transwell permeability assay. Whole-mount immunostainings of the embryonic vasculature in Kleip-mutants exhibited in comparison to their wild-type littermates significantly extended cranial vessels suggesting as well as for the bleedings a failure in the recruitment of mural cells to the nascent vessels. Interestingly, specific NG2 immunostainings displayed no alterations in pericyte coverage-mediated vessel stabilization thereby rather indicating defects in endothelial adhesion. Moreover, Kleip was identified to be indispensable for neonatal development. Homozygous offspring exhibited a high neonatal mortality from around 50% due to respiratory failure. Histological analysis of newborn mutant lungs exhibited reduced airspace, and marked thickening of alveolar septae, which represent the characteristic features of maturation defects. Thus, our studies demonstrate the importance of Kleip for lung morphogenesis and suggest that it could possibly be involved in the pathogenesis of respiratory distress syndroms (RDS). In additional subprojects selected proteins of the G-protein signaling cascade were characterized with regard to angiogenesis. On the one hand it could be shown for the first time that the dock180 and elmo1 formed GEF for the small GTPase Rac1 is expressed in the zebrafish endothelium. Furthermore, the spatially and temporarily restricted photoactivatable morpholino-based expression-silencing of elmo1 in the ventral mesoderm severely impaired the formation of the fish vasculature, suggesting an endothelial cell autonomous function of elmo1. Next to the analysis of GEFs during angiogenesis the downstream mediators of RhoA signaling were analyzed. In previous studies the pharmacological inhibition of both serine/threonine kinases ROCK I/II with the relative unspecific inhibitor Y-27632 revealed contrary results. Here it could be demonstrated that inhibition of ROCK I/II activity with the inhibitor H-1152 enhanced endothelial signaling implicating that both kinases function as negative regulators of sprouting angiogenesis. In conclusion, all analyzed G-protein signaling molecules were identified as essential regulators involved in the formation of a functional vasculature.

Translation of abstract (German)

Die Mitglieder der Rho-Familie der kleinen GTPasen wurden ursprünglich durch ihre Beteiligung an einer Vielzahl von zellulären Prozessen identifiziert. Sie sind unter anderem an der Regulation des F-Aktin-Zytoskelettes und der Mikrotubuli-Dynamik, Zellpolarität, Vesikeltransport und Genexpression beteiligt. Zudem wurde in neueren Studien den G-Proteinen eine Funktion als Schlüsselregulator innerhalb der Angiogenese zugewiesen. So konnte gezeigt werden, dass der G-Protein-Signaltransduktionsweg dabei stark mit angiogenen Prozessen wie der Regulation der vaskulären Permeabilität, dem Umbau der extrazellulären Matrix, der endothelialen Migration, Proliferation, Morphogenese und dem Überleben assoziiert ist. Vieles von unserem derzeitigen Kenntnisstand bezüglich der G-Protein-Signalweiterleitung wurde überwiegend durch In-vitro-Experimente oder durch In-vivo-Studien mit wirbellosen Tieren gewonnen. Jedoch ist wenig über ihre Regulation und Funktion bei Wirbeltieren bekannt. Aus diesem Grund lag das Ziel dieser Arbeit darin, die Funktion von ausgewählten G-Proteinen während der Wirbeltierentwicklung und insbesondere in der Angiogenese zu charakterisieren. Erst kürzlich wurde das mit dem Guanin-Nukleotid-Austausch-Faktor (GEF) Ect-2 interagierende BTB-kelch-Protein KLEIP (KLHL20) mit der Angiogenese als neuer und wichtiger Regulator der endothelialen Funktion, welcher die VEGF-induzierte Aktivierung der kleinen GTPase RhoA kontrolliert, assoziiert. Um die Funktion von Kleip während der Angiogenese in vivo, sowie in der Entwicklung, zu studieren, wurde das Kleip-Gen in Mäusen ausgeschaltet. Die konstitutive Inaktivierung von Kleip mittels der Gene-Trap-Methode führte zu einem teilweisen letalen Phänotyp. Ein geringer Anteil von Kleip-defizienten Embryonen starb während der Embryonalentwicklung infolge von kranialen Blutungen. Diese Fehlfunktion innerhalb der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität wurde weiterhin durch Studien mit Spleiß-blocking Morpholino-induzierter klhl20 Herunterregulation in Zebrafischembryonen, sowie durch einen In-vitro-Permeabilitäts-Transwell-Assay unterstützt. Die embryonalen Gefäße in Kleip-Mutanten wiesen nach whole-mount Immunfärbungen im Vergleich zu ihren Wildtyp-Geschwistern deutlich erweiterte kraniale Gefäße auf. Dieses deutet neben den beobachteten Blutungen ebenfalls auf einen Fehler in der Rekrutierung von muralen Zellen zu den sich bildenden Gefäßen hin. Interessanterweise zeigten spezifische NG2 Immunfärbungen keine Veränderungen in der durch Perizyten vermittelten Gefäßstabilisierung. Diese Beobachtungen lassen in ihrer Gesamtheit daher eher einen Fehler innerhalb der adhesiven Eigenschaften von Endothelzellen vermuten. Desweiteren wurde Kleip als unverzichtbares Molekül für die neonatale Entwicklung identifiziert. Homozygote Nachkommen zeigten eine durch Atemnot verursachte hohe Säuglingssterblichkeit von ungefähr 50 Prozent. Histologische Untersuch-ungen der Lungen von neugeborenen Mutanten zeigten einen reduzierten Alveolarraum und eine deutliche Verdickung der alveolaren Septen. Diese beiden morphologischen Veränderungen sind charakteristische Merkmale für Mängel in der Lungenreifung. Demnach zeigen unsere Studien den hohen Stellenwert von Kleip für die Lungen-Morphogenese und lassen eine mögliche Beteiligung in der Pathogenese des respiratorischen Distress-Syndromes (RDS) erkennen. In zusätzlichen Teilprojekten wurden weitere ausgewählte Proteine der G-Protein-Signalkaskade im Hinblick auf die Angiogenese untersucht. Einerseits konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der von dock180 und elmo1 gebildete GEF für die kleine GTPase Rac1 im Zebrafischendothel exprimiert wird. Außerdem resultierte die räumlich und zeitlich begrenzte Expressionsminderung von elmo1 im ventralen Mesoderm mittels einem photoaktivierbaren Morpholino in einer starken Beeinträchtigung in der Entwicklung der Fischvaskulatur, wodurch elmo1 eine zellautonome Funktion im Endothel zugwiesen wird. Neben der Analyse von GEFs und deren Rolle in der Angiogenese wurden auch die nachgelagerten Mediatoren des RhoA Signalweges untersucht. In früher durchgeführten Angiogenese relevanten Studien führte die pharmakologische Hemmung der beiden Serin/Threonin-Kinasen ROCK I/II mit dem relativ unspezifischen Inhibitor Y-27632 zu gegensätzlichen Ergebnissen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der ROCK I/II-Aktivität durch den Einsatz des Inhibitors H-1152 zu einer verstärkten Signalweiterleitung im Endothel führt. Folglich wird beiden Kinasen eine Rolle als negative Regulatoren der Angiogenese nachgesagt. Zusammenfassend konnten alle untersuchten G-Protein-Signalmoleküle als essentielle Regulatoren in der Bildung eines funktionellen Gefäßsystems identifiziert werden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 1. April 2011
Date Deposited: 05. Apr 2011 12:29
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Angiogenesis , small GTPases , vascular integrity
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