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Nano- und Mikronanostrukturen zur Untersuchung und nanotechnologischen Anwendung von Motorproteinen

Plath, Nicole

English Title: Nano- and micronanostructures for the investigation and application of motor proteins

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PDF, German
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Abstract

Motorproteine sind komplexe Nanomaschinen, die chemische Energie aus der Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) in mechanische Energie umwandeln und so gerichtete Bewegung mit extrem hoher Spezifität und Effizienz ausführen. Sie sind essentiell für die Funktion lebender Organismen, da sie maßgeblich an überlebenswichtigen Prozessen wie der Zellteilung beteiligt sind. Das Verständnis ihrer Funktion ist die Basis um das Potential dieser Enzyme in der Nanotechnologie zu nutzen sowie Krankheiten zu verstehen, die auf defekten Motorproteinen beruhen, und Therapien zu ihrer Heilung zu entwickeln. Trotz reger Aktivität auf dem Gebiet liegen für viele Motorproteine nur wenige Informationen bezüglich der Wechselwirkung mit anderen Proteinen und des Verhaltens bei Einwirkung chemischer Substanzen vor. Eine der Standardmethoden zur Untersuchung molekularer Motoren in vitro sind so genannte Gleitexperimente, in denen Motorproteine auf Oberflächen angebunden werden und fluoreszenzmarkierte Filamente über die Oberfläche transportieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Durchführung dieser Gleitexperimente auf Oberflächen, die mit hexagonal angeordneten Goldnanopartikeln dekoriert sind, entwickelt. Die molekularen Motoren werden hierzu über Chelatisierung einer rekombinant eingeführten Histidinfunktionalisierung durch Übergangsmetallchelatoren gerichtet auf den Goldnanostrukturen immobilisiert. Die Nanopartikel dienen somit als Ankerpunkte. Das System weist den Vorteil auf, dass ein Motorprotein pro Partikel immobilisiert werden kann. Zusätzlich kann ihre Dichte über den Abstand der Partikel kontrolliert werden. Das entwickelte Substrat erlaubt die Untersuchung aller mit einer Histidinsequenz funktionalsierten Motorproteine. Seine Eignung zur Untersuchung von Motorproteinen in Gleitexperimenten wurde mittels der Untersuchung eines gut erforschten Kinesin-1 Konstrukts demonstriert. Dieses zeigte literaturbekanntes Verhalten. Zusätzlich zum Gleitexperiment wurde ein Funktionalitätsnachweis entwickelt, der die Aktivität der orientiert auf den Goldnanopartikeln angebundenen Motorproteine unter den im Gleitexperiment gewählten Bedingungen überprüft. Dieser Nachweis stellt eine wichtige Ergänzung des Gleitexperiments zur Überprüfung der Aktivität der Motorproteine auf molekularer Ebene dar. Die Kombination der beiden Methoden ermöglicht die zuverlässige in vitro Untersuchung des Verhaltens von Motorproteinen unter Sicherstellung des Erhalts ihrer Aktivität und erlaubt es so Informationen zum Verständnis molekularer Motoren zu erlangen. Molekulare Motoren zählen in vivo zu den Hauptbestandteilen gerichteter molekularer Transportsysteme. Dies prädestiniert sie für eine Verwendung zum Aufbau effizienter in vitro-Nanotransportsysteme. Das Ziel dieser Arbeit war daher neben der Entwicklung der oben genannten Methoden die Entwicklung von Templaten zur Erzeugung so genannter molekularer Fließbänder. Als molekulare Fließbänder werden unter Kontrolle der Polarität auf strukturierten Oberflächen angebundene Mikrotubuli bezeichnet, auf denen sich Motorproteine gerichtet bewegen. Im Rahmen der Arbeit wurden mikronanostrukturierte Oberflächen hergestellt, die der polaritätsorientierten Anbindung und gerichteten Polymerisation von Mikrotubuli dienen. Hierbei handelt es sich um Oberflächen auf denen nanostrukturierte Bereiche in der Dimension einiger Mikrometer bis einiger hundert Nanometer von unstrukturierten Bereichen umgeben sind. Die erfolgreiche Funktionalisierung der Goldnanopartikel mit Übergangsmetallchelatoren oder Streptavidin, die eine Anbindung von Mikrotubuli ermöglichen, wurde durchgeführt. Somit wurden erfolgreich Template zur Erzeugung molekularer Fließbänder hergestellt.

Translation of abstract (English)

Motor proteins are complex nanomachines that convert chemical energy derived from the hydrolysis of ATP into mechanical work and use it to perform directed motion with extremely high efficiency and specificity. They play an essential role in living organisms because they are involved in vital processes like cell division. Therefore insight in their function provides the basis to use their great potential in nanotechnology, understand diseases that are based on damaged motor proteins and develop therapies against these diseases. Despite a lot of research activity in this field, for many motor proteins little is known about the interplay with other proteins or chemicals. One of the standard methods to investigate molecular motors in vitro are so called gliding assays. These assays are based on motor proteins immobilized on surfaces to transport fluorescently labeled filaments across the surface. Within the scope of this study a technique to perform these gliding assays on surfaces that are decorated with hexagonally ordered gold nanoparticles was developed. To couple motor proteins in a site-directed manner, gold nanoparticles were functionalized with transition metal chelators and proteins were immobilized via their recombinantly introduced histidine tags. The particles serve as anchor points for site-specific immobilization of motor proteins. Due to the size of these particles immobilization of exactly one protein per particle is possible. Additionally it is possible to control the motor protein density by varying the interparticle spacing. This method presents a universal tool for the investigation of histidine-tagged motor proteins. To prove the suitability of these substrates for the investigation of motor proteins the well-studied kinesin-1 was used. The observed behavior is in line with its behavior reported in literature. Furthermore an assay to control the activity of motor proteins site-specifically coupled to gold nanoparticles was performed under the conditions used in the gliding assay. This assay is an important supplement to the gliding assay because it enables to control the activity of the motor proteins on the molecular scale. Combining these two methods reliably allows investigating the performance of motor proteins in vitro while ensuring the preservation of their activity. Molecular motors are one of the main constituents of molecular transport in vivo. This makes them an ideal material for building up efficient in vitro nanotransport systems. Keeping this in mind, one of the objectives of this work was the development of so called molecular tracks. Molecular tracks are polarity orientated microtubules that are immobilized on surfaces and serve as tracks for the movement of motor proteins. Within the scope of this work micronanostructured surfaces that serve for the polarity orientated immobilization and polymerization of microtubules were produced. These 4 Summary surfaces are hierarchically structured with micrometer-sized patches of gold nanopatterns surrounded by non-structured areas with feature sizes ranging from some micrometers to several hundred nanometers. By functionalizing these hierarchically structured gold nanoparticles with transition metal chelators or streptavidin templates for the production of molecular tracks were successfully produced.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim P.
Date of thesis defense: 28 January 2011
Date Deposited: 04 May 2011 10:14
Date: 2011
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Nanopartikel, Molekularer Motor, Kinesin
Uncontrolled Keywords: Motilitätsuntersuchungen , Funktionalitätsnachweis , Molekulare Fließbändergold nanoparticle , kinesin , motility assay , functionality assay , molecular tracks
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