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Developing novel strategies for oncolytic adenovirus therapy by host cell gene expression profiling and arming with therapeutic antibodies

Dorer, Dominik

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Abstract

Die virale Onkolyse oder Virotherapie ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Krebserkrankungen und wurde unter anderem klinisch getestet für onkolytische Adenoviren. Jedoch schwankt die therapeutische Wirksamkeit von Fall zu Fall, was daran liegen könnte, dass Krebszellen nicht die natürlichen Wirtszellen von Adenoviren sind. Ziel meiner Doktorarbeit war es Adenovirus 5 Infektionen in ihrem natürlichen Umfeld primärer Bronchialepithelzellen und verschiedener Krebszellen zu untersuchen, um Gene und zelluläre Signalwege zu finden, die einen Einfluss auf die adenovirale Replikation haben. Unter anderem konnte ich zeigen, dass in Bronchialepithelzellen die frühe virale Genexpression und DNA Replikation sehr schnell einsetzt, verbunden mit einer hohen Zytotoxizität. Dagegen war die frühe virale Genexpression als auch die DNA Replikation in zwei Melanomzelllinien stark verlangsamt, verbunden mit einer geringen Zytotoxizität. Genexpressionsanalysen mittels Microarray in infizierten Bronchialepithelzellen und jener Melanomzelllinien konnten zeigen, dass in den jeweiligen Zelltypen unterschiedliche Expressionsmuster einzelner Gene und zellulärer Signalwege vorlagen. Der am stärksten beeinflusste Signalweg reguliert den Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus und war in den primären Bronchialepithelzellen aktiviert, aber nicht in den Melanomzelllinien. Anhand der Daten konnte eine Strategie zur verbesserten Onkolyse in einzelnen Melanomzelllinien entwickelt werden. Dafür wurden Adenovirus infizierte Melanomzellen zusätzlich mit dem Chemotherapeutikum Temozolomid behandelt. Ein weiteres Ziel meiner Arbeit war es, die Wirksamkeit onkolytischer Adenoviren durch die Expression von therapeutischen Antikörpern zu verbessern. Dafür habe ich tumorspezifische Adenoviren mit einem rekombinanten „single-chain“ Antikörper-Gen ausgerüstet. Die Antikörper erkennen das Tumor-assoziierte karzinoembryonale Antigen und verfügen außerdem über die Effektordomäne des Typ G Immunglobulins 2a, um eine Antikörper vermittelte Immunantwort gegen Krebszellen zu richten. Zuerst wurden verschiedene Expressionskonstrukte für eine optimale Antikörperproduktion mit dem adenoviralen „major late promoter“ getestet. Dabei wurden zwei effiziente Expressionskonstrukte identifziert, die sogenannte „internal ribosomal entry site“ und ein Spleiß-Akzeptor des humanen Adenovirus 40. Anschließend wurden die rekombinant hergestellten Antikörper im Western Blot, ELISA und mittels Durchflusszytometrie auf ihre Funktionalität geprüft. Eine erfolgreiche Antikörper-Antigen Reaktion konnte in-vitro als auch anhand lebender Tumorzellen gezeigt werden.

Translation of abstract (English)

Oncolytic adenoviruses are promising candidates for treatment of various cancer entities with a favorable safety profile and therapeutic efficacy in individual cases. However, it has been neglected so far to investigate whether the observed varying efficacy in clinical trials could be due to differences in the cellular environment, between tumor cells and the virus’s natural host cells, which may influences successful virus replication. My aim was to analyze wild type adenovirus 5 infections in primary human bronchial epithelial cells and various tumor cells by microarray analysis in order to reveal pathways that differentially affect oncolytic adenovirus replication. Kinetics of early viral gene expression and DNA replication together with cytotoxicity assays showed that primary bronchial epithelial cells optimally supported adenovirus infection. In contrast, infection of the two melanoma cell lines SK-MEL-28 and Mel624 revealed delayed early viral gene expression and slower DNA replication and decreased cytotoxicity. Microarray analysis of these melanoma cells versus primary bronchial epithelial cells led to the identification of differentially expressed genes and activated cellular pathways. The most prominent one, called the G1/S-phase transition pathway, was strongly activated in the primary bronchial epithelial cells but not in melanoma. The data helped to develop a strategy which enhanced viral replication in SK-MEL-28 cells by combining chemotherapy using temozolomide and viral oncolysis. Another aim of my work was to enhance therapeutic efficacy of oncolytic adenoviruses by combining viro- and antibody therapy. Therefore, I armed tumor-selective adenoviruses with a gene encoding a recombinant single-chain antibody directed against the well-established carcinoembryonic antigen. As effector domain the constant domain of immunoglobulin type G2a was selected which is able to mediate anti-tumor immune cell activation by antibodymediated cytotoxicity. First, different tools to facilitate efficient antibody production via the adenoviral major late promoter were compared, identifying an internal ribosomal entry site and a splice acceptor from the human adenovirus 40 as the most potent ones. Then, antibodies expressed after infection with recombinant adenoviruses were analyzed by Western Blot, ELISA, and flow cytometry. These assays demonstrated that the recombinantly produced antibodies were fully functional regarding their ability to bind the carcinoembryonic antigen in-vitro and on living tumor cells.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Nettelbeck, Dr. PD Dirk M.
Date of thesis defense: 25. March 2011
Date Deposited: 29. Apr 2011 13:51
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Adenovirus 5, Microarray
Uncontrolled Keywords: Oncolysis , Virotherapy
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