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Polycomb Group Proteins in the freshwater polyp Hydra

Matt, Sonja

German Title: Polycomb Group Proteine im Süßwasserpolypen Hydra

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Abstract

During the development of a multicellular organism, different cell types with specific functions have to be generated, although the cells contain the same genetic information. This is achieved by a cell type specific expression of genes. The gene expression pattern and the identity of the cell have to be maintained for several rounds of cell division. The growing field of epigenetics deals with the inheritance of traits, which are not determined in the underlying DNA sequence. The long-term maintenance of gene expression patterns, which can be described as a kind of a cellular memory, is counted among epigenetic mechanisms. Different epigenetic inheritance systems like chromatin remodeling exist. For instance, the chromatin structure can be altered by the histone modifying Polycomb Group (PcG) proteins. The PcG proteins are responsible for the inheritance of the repressed state. Many genes, which are controlling development, differentiation and the cell cycle, are regulated by PcG proteins. The proteins have been shown to act as large multiprotein complexes, so-called Polycomb Repressive Complexes (PRCs). In the scope of this thesis, PcG and associated proteins have been characterized in the freshwater polyp Hydra. The PcG genes Scm and Pho/YY1 could be identified in the Hydra genome and have been cloned. Together with the already identified proteins of the PRC1 and PRC2 complexes, Hydra possesses a complete set of PcG proteins. A comparison with homologous proteins of other species could demonstrate that the functional domains of the Hydra PcG proteins are highly conserved. Interestingly, the genes of the PRC2 complex are exclusively expressed in one of the three cell lineages of Hydra. The genes are expressed in the so-called interstitial cell lineage. Studies with sexual polyps could show that the genes are also expressed in the gonads of the animals. The cell line specific expression of the genes in Hydra seems to separate interstitial cells from the epithelial cell lineages. The DNA binding protein HyYY1 has been of special interest in this study. It is a homolog of the Drosophila protein Pho and of the human transcription factor YY1. Pho can be found in a PcG complex termed PhoRC (Pleiohomeotic Repressive Complex) in combination with dSfmbt. This complex is responsible for the recruitment of the other PcG complexes to their target genes in the fruit fly. YY1 acts as a ’molecular adapter’ and links the PcG complexes to so-called Polycomb Response Elements (PREs). These cis-regulatory elements can be found close to target genes and are important for the recruitment of the PcG complexes. The Hydra protein has both a zinc finger domain, which is responsible for the DNA binding, and a so-called REPO domain, which is necessary for the interaction with the PRCs. With the help of gel retardation assays, it could be demonstrated that HyYY1 can effectively interact with the DNA in a sequence-specific manner. The consensus sequence is equivalent to the CCAT-motif found in Drosophila and mammals. In the fruit fly, this sequence can be found within PREs. A polyclonal antibody against recombinantly expressed HyYY1 has been generated during this study - making immunohistochemical analyses and immunoprecipitations (IPs) possible. An indication of the interaction of HyYY1 with other PcG proteins could be provided by a Co-IP. However, this preliminary result has to be verified. In addition, it should be kept in mind that the recruitment of PcG complexes in Hydra is not necessarily dependent on Pho/YY1 and PRE sites. At least for mammals, other recruiting mechanisms are known. The existing antibodies against HyYY1 and otherHydra PcG proteins render chromatin-IPs to identify target genes possible. Next-generation sequencing technologies will enable large-scale ChIP-Seq experiments and the future identification of PcG target genes in Hydra.

Translation of abstract (German)

Während der Entwicklung eines vielzelligen Organismus müssen unterschiedliche Zelltypen mit spezifischen Funktionen gebildet werden, obwohl alle Zellen dieselbe Erbinformation enthalten. Dies wird durch eine zelltypspezifische Expression von Genen erreicht. Das Genexpressionsmuster - und damit die Identität der Zelle, muss über viele Zellteilungen hinweg aufrecht erhalten werden. Das wachsende Feld der Epigenetik beschäftigt sich mit der Vererbung von Merkmalen, die nicht in der DNS-Sequenz festgelegt sind. Darunter fällt auch die langfristige Aufrechterhaltung von Genexpressionsmustern, welche auch als eine Art 'Zellgedächtnis' bezeichnet werden kann. Es existieren verschiedene epigenetische Vererbungssysteme, wie beispielsweise der Chromatinumbau ('chromatin remodeling'). Die Chromatinstruktur kann unter anderem durch die Histon-modifizierenden Polycomb Group (PcG) Proteine derart verändert werden, dass die Transkription verhindert wird. PcG Proteine sind für die Vererbung des reprimierten Zustandes verantwortlich. Viele Gene, welche die Entwicklung, die Differenzierung und den Zellzyklus kontrollieren, werden durch PcG Proteine reguliert. Die Proteine agieren dabei als große Multiproteinkomplexe, sogenannte Polycomb Repressive Complexes (PRCs). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Polycomb Group (PcG) und assoziierte Proteine im Süßwasserpolypen Hydra näher untersucht. Hydra gehört zum Stamm der Nesseltiere und zählt zu den 'basalen Metazoen'. Erstaunlicherweise spiegelt der einfach strukturierte Körperbau nicht die Komplexität des Hydra-Genoms wider. Komponenten sämtlicher Signalwege, welche für die Entwicklung und Musterbildung in höheren Tieren verantwortlich sind, wurden in Hydra gefunden. Da PcG basierte Mechanismen der Genregulation bisher nur in höheren Metazoen wie Drosophila oder Säugern näher untersucht worden sind, ist der Süßwasserpolyp ein idealer Modellorganismus, um die evolutionären Aspekte zu erforschen. Im Laufe dieser Arbeit konnten die PcG Gene Scm und Pho/YY1 im Hydra-Genom identifiziert und kloniert werden. Zusammen mit den in früheren Studien identifizierten PcG Proteine der PRC1 und PRC2 Komplexe besitzt Hydra damit einen vollständigen Satz an PcG Proteinen. Durch den Vergleich mit homologen Proteinen anderer Organismen konnte gezeigt werden, dass vor allem die funktionellen Domänen der PcG Proteine in Hydra hoch konserviert sind. Interessanterweise werden die Gene des PRC2 Komplexes ausschließlich in einer der drei Zelllinien von Hydra exprimiert. Die Gene werden in der sogenannten interstitiellen Zelllinie, welche mit adulten Stammzellen in höheren Organismen vergleichbar ist, exprimiert. Anhand von Studien an geschlechtlichen Polypen konnte außerdem gezeigt werden, dass die Gene in den Gonaden der Tiere exprimiert werden. Die zelllinienspezifische Expression der Gene in Hydra scheint eine Abgrenzung der interstitiellen Zellen von den beiden Epithelzelllinien darzustellen. Von besonderem Interesse war das DNS bindende Protein HyYY1, welches ein Homolog des Drosophila Proteins Pho und des humanen Transkriptionsfaktors YY1 ist. In der Fruchtfliege bildet Pho zusammen mit dSfmbt einen PcG Komplex namens PhoRC (Pleiohomeotic Repressive Complex), welcher für die Rekrutierung der anderen PcG Proteinkomplexe zu den Zielgenen verantwortlich ist. Das Hydra Protein besitzt sowohl vier Zinkfinger, welche für die DNS-Interaktion verantwortlich sind, als auch eine REPO-Domäne, welche für die Interaktion mit den PcG Komplexen notwendig ist. Anhand von Gelretardations-Analysen konnte gezeigt werden, dass HyYY1 tatsächlich sequenzspezifisch mit der DNS interagieren kann. Die Konsensussequenz entspricht dem CCAT-Motiv von Drosophila und Säugern. In der Fruchtfliege wird diese Sequenz in sogenannten Polycomb Response Elements (PREs) gefunden. Diese cis-regulatorischen Elemente werden in der Nähe von Zielgenen gefunden und sind für die Rekrutierung der PcG Proteine von Bedeutung. Anhand des Pho/YY1 Konsensusmotivs konnten bereits PcG Zielgene in Drosophila identifiziert werden. Während dieser Arbeit wurde ein polyklonaler Antikörper gegen rekombinant exprimiertes HyYY1 hergestellt, welcher immunhistochemische Analysen und Methoden wie die Immunpräzipitation (IP) erlaubt. Durch eine Co-IP konnte ein anfänglicher Hinweis auf die Interaktion von HyYY1 mit anderen PcG Proteinen erbracht werden. Dieses vorläufige Ergebnis muss allerdings verifiziert werden. Desweiteren sollte bedacht werden, dass die Rekrutierung der PcG Komplexe in Hydra nicht zwangsläufig über Pho/YY1 und PREs erfolgen muss. Zumindest in Säugern wurden weitere Mechanismen der Rekrutierung gefunden. Die vorhandenen Antikörper gegen HyYY1 und weitere Hydra PcG Proteine ermöglichen zudem Chromatin-IPs zur Identifizierung von Zielgenen. Sequenziertechniken der neuen Generation erlauben die zukünftige Durchführung von ChIP-Experimenten im größeren Maßstab und die Identifizierung von PcG-Zielgenen in Hydra.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Petersen, Prof. Dr. Gabriele
Date of thesis defense: 14. April 2011
Date Deposited: 29. Apr 2011 13:32
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hydra magnipapillata, Epigenetik
Uncontrolled Keywords: Polycomb Group Proteine , Pho/YY1 , ProteininteraktionenPolycomb Group proteins , Pho/YY1 , Protein interactions
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