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Antisense studies on base excision repair genes and their effects on cellular sensitivity to ionizing radiation

Hausmann, Sebastian

German Title: Antisense-Studien an Basenexzisionsreparaturgenen und ihre Auswirkungen auf die zelluläre Strahlenempfindlichkeit

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Abstract

Introduction: The base excision repair (BER) pathway is considered to be one of the most important pathways involved in the repair of DNA damage induced by ionizing radiation (IR). The DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase (APEX1) and the DNA repair enzyme XRCC1 are two of its key players. Inconsistent data exist for the association between APEX1 and XRCC1 expression and cellular radiosensitivity. Some investigators have demonstrated a positive association, while others have shown little or no correlation. This study aims to investigate the effects of a decrease in the expression of APEX1 and XRCC1 on (i) growth characteristics, (ii) the survival and the cellular sensitivity to ionizing radiation, and (iii) the radiation-induced DNA damage. Gene expression profiles were determined after silencing and after additional irradiation with 5 Gy to identify possible alternative backup repair pathways and differences in the radiation response between normal and cancer cells. Thus, the study will elucidate whether imbalances in BER are associated with altered radiosensitivity. Such imbalances can be used to predict the radiation response after irradiation in cancer patients and will contribute to the understanding of normal tissue toxicity due to genetic variation in BER genes. Methods: Gene defects were analyzed in two different cell types, the breast adenocarcinoma cell line, MCF7, and a healthy counterpart, the human mammary epithelial cells HMEpC. The APEX1 and/or the XRCC1 gene were silenced in both cell types by applying the RNAi knockdown technique. Clonogenic assay and Sulforhodamine B assay were performed to assess growth characteristics and sensitivity to radiation. DNA damage after irradiation was evaluated with the DNA single-strand break specific alkaline comet assay and the gamma-H2AX assay, which uses an antibody specific for the phosphorylated form of the variant histone H2AX (gamma-H2AX) at DNA double-strand breaks. Gene expression profiles were determined on Illumina BeadChip Human Sentrix-8 arrays. Results: At the time of irradiation, APEX1 and XRCC1 mRNA amounts were decreased by more than 80 % in silenced cells, which led to reduced protein levels of up to 90 % in MCF7 cells, and up to 86 % in HMEpC. The silencing did not affect the IR-induced p53 response measured by quantification of CDKN1A mRNA levels. In MCF7, a reduced plating efficiency and growth capability was determined in XRCC1 knockdown cells. Silencing of APEX1 also resulted in a reduced growth compared to controls. No difference was observed in DNA repair rates. However, APEX1-silenced cells showed a trend towards lower initial single-strand breaks after irradiation, whereas XRCC1-silenced cells showed a trend towards a higher damage. In HMEpC, the silencing did not affect growth or the initial damage induction. The functional consequences caused by the simultaneous knockdown of APEX1 and XRCC1 were comparable to the controls in both cell types. Further, the irradiation of APEX1- and/or XRCC1-silenced cells and control showed no significant differences regarding radiation sensitivity in both cell types. However, these observations are accompanied by a cell type-specific deregulation of DNA repair genes and genes involved in the cell cycle, the cellular growth, and the proliferation. In particular, genes from the nucleotide excision repair (NER) and mismatch repair (MMR) pathway were induced in silenced cells after irradiation. Conclusions: We have established a cell model to study the effect of a deficiency in BER on cellular radiosensitivity. After silencing APEX1 and/or XRCC1, we did not observe an altered radiosensitivity compared to controls. The response to radiation and the efficiency of BER depend on all BER components and their multiple interactions within the cell. An imbalance in one of the enzymes may be compensated by other components. Based on our results, we assume that i) the APEX1-independent pathway and a possible XRCC1-independent pathway are used in situations with reduced availability of one of the proteins, and ii) other pathways such as NER and MMR are able to serve as a backup repair mechanism to repair radiation-induced DNA damage in double knockdown cells. This study suggests that APEX1 and XRCC1 are useful targets to modulate cellular responses to DNA damaging agents including IR. Our dataset offers several scientific directions for future studies with the aim to further investigate the mechanisms responsible for the different functions of APEX1 and XRCC1 in BER in primary and cancer cells.

Translation of abstract (German)

Einführung: Die Basen-Exzisions-Reparatur (BER) ist einer der wichtigsten Mechanismen zur Reparatur von DNA-Schäden, die durch die Einwirkung von ionisierender Strahlung entstehen. Das Enzym Apurinische Endonuklease 1 (APEX1) und das DNA-Reparaturenzym XRCC1 spielen eine Schlüsselrolle bei der BER. Es gibt nur widersprüchliche Daten, die einen Zusammenhang zwischen der Expression von APEX1 und XRCC1 hinsichtlich der zellulären Strahlenempfindlichkeit nachweisen. Diese Arbeit untersucht die Auswirkungen einer verminderten Expression von APEX1 und/oder XRCC1 auf (i) das Wachstumsverhalten, (ii) das Überleben und die zelluläre Strahlenempfindlichkeit und (iii) die Induktion und die Reparatur strahlen-induzierter DNA-Schäden. Desweiteren wurden Genexpressionsprofile von Zellen mit herunter reguliertem APEX1 und/oder XRCC1 und nach zusätzlicher Behandlung mit ionisierender Strahlung (5 Gy) erstellt, um alternative Reparaturmöglichkeiten und Unterschiede in der Strahlenantwort zwischen primären Zellen und Krebszellen zu erfassen. Auf diese Weise soll untersucht werden, ob ein Ungleichgewicht in der BER mit einer veränderten Strahlenempfindlichkeit assoziiert ist. Ein solches Ungleichgewicht könnte zur Vorhersage der Strahlenantwort in Krebspatienten, die eine Bestrahlung erhalten haben, genutzt werden. Desweiteren werden die Daten zum Verständnis der Strahlentoxizität aufgrund genetischer Unterschiede in BER Genen beitragen. Methoden: Die Gendefekte wurden in zwei unterschiedlichen Zelltypen untersucht, zum einen in der Brustadenokarzinom-Zelllinie MCF7, sowie in Brustepithelzellen einer gesunden Spenderin, HMEpC. Um die Expression der Gene APEX1 und/oder XRCC1 zu vermindern, wurde RNA-Interferenz angewendet. Die Wachstumseigenschaften und die Strahlenempfindlichkeit wurden mit dem Clonogenic Assay und der Sulforhodamin B Assay bestimmt. Einzelstrangbrüche nach Bestrahlung wurden spezifisch mit dem alkalischen Comet-Assay, Doppelstrangbrüche (DSB) mit dem gamma-H2AX Assay gemessen. Die Genexpressionsprofile wurden auf Illumina BeadChips Human Sentrix-8 Arrays bestimmt. Ergebnisse: Zum Zeitpunkt der Bestrahlung waren sowohl die APEX1 als auch die XRCC1 mRNA um mehr als 80 % verringert. Die Proteinmengen waren um bis zu 90 % in den MCF7 Zellen und um bis zu 86 % in den primären Zellen reduziert. Diese Verminderung hatte jedoch keinen Einfluss auf die strahlen-induzierte p53-Antwort, welche durch Quantifizierung der CDKN1A mRNA gemessen wurde. In MCF7-Zellen führte die Reduktion von XRCC1 zu geringerer Anheftungseffizienz und vermindertem Wachstum. Letzteres wurde auch in Zellen mit reduzierter APEX1-Expression beobachtet. Hinsichtlich der DNA-Reparaturraten wurde kein Unterschied festgestellt. Jedoch zeigten APEX1-verminderte Zellen einen Trend für weniger Einzelstrangbrüche direkt nach Bestrahlung und XRCC1-verminderte Zellen einen Trend für vermehrte Einzelstrangbrüche. In HMEpC hatte die Reduktion von APEX1 und/oder XRCC1 keine Auswirkungen auf das Wachstum oder die initialen DNA Schäden nach Bestrahlung. Die gleichzeitige Verminderung von APEX1 und XRCC1 hatte, verglichen mit den Kontrollen, keine Auswirkungen in beiden Zelltypen. Darüber hinaus zeigten APEX1 und/oder XRCC1 verminderte Zellen keine signifikanten Unterschiede bei der Strahlenempfindlichkeit. Dennoch gehen diese Beobachtungen mit zelltypspezifischen Deregulierungen von DNA Reparaturgenen und Genen, die in der Zellzykluskontrolle, im Zellwachstum, und der Proliferation eine Rolle spielen, einher. Insbesondere waren Gene aus dem Nukleotid-Exzisions-Reparaturweg (NER) und dem Mismatch-Reparaturweg (MMR) nach Bestrahlung der APEX1 und XRCC1 verminderten Zellen verstärkt exprimiert. Schlussfolgerungen: Wir haben ein Zellmodell etabliert, mit dem die Auswirkungen einer unzureichenden BER auf die zelluläre Strahlenempfindlichkeit untersucht werden konnte. Nach Reduktion von APEX1 und/oder XRCC1 konnten zwar Veränderungen im Wachstum aber nicht in der Strahlenempfindlichkeit im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet werden. Die zellulären Reaktionen nach Bestrahlung und die Effizienz der BER hängen von allen Komponenten der BER und ihren Interaktionen ab. Eine gestörtes Gleichgewicht in einem der Enzyme vermag durch ein anderes ausgeglichen werden. Aufgrund unserer Ergebnisse zur Genexpression nehmen wir an, dass (i) der APEX1-unabhängige und ein möglicher XRCC1-unabhängiger Reparaturweg in Situationen mit verminderter Verfügbarkeit in einem der beiden Proteine genutzt wird, und (ii) andere Reparaturwege, wie NER und MMR, als alternative Reparaturwege strahleninduzierte DNA-Schäden reparieren können. Unsere Arbeit legt nahe, dass APEX1 und XRCC1 wertvolle Ziele sind, um die zellulären Reaktionen hinsichtlich DNA-schädigender Agenzien, einschließlich ionisierender Strahlung, zu modifizieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Popanda, Dr. PD Odilia
Date of thesis defense: 31. March 2011
Date Deposited: 29. Apr 2011 13:58
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Strahlensensibilität, DNS-Reparatur, Genexpression, RNS-Interferenz
Uncontrolled Keywords: radiosensitivity , DNA repair , gene expression , RNA interference
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