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Protein-Interaktionsanalysen der gastrointestinalen Stromatumor-assoziierten Rezeptortyrosinkinase c-Kit zur Identifizierung und Charakterisierung neuer Wirkstoffziele

Panke, Jutta

English Title: Protein interaction analysis of the gastrointestinal stromal tumor associated receptor tyrosine kinase c-Kit for identification and characterisation of novel drug targets

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PDF, German
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Abstract

Gastrointestinale Stromatumore (GIST) sind typischerweise auf eine aktivierende Mutation in der Rezeptortyrosinkinase c Kit zurückzuführen. Eine Behandlung mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib führt bei der großen Mehrheit der Patienten zunächst zu einer Tumorregression. Nach durchschnittlich zwei Jahren entwickeln viele Patienten eine Resistenz gegen Imatinib, die sehr häufig mit einer sekundären Mutation in c Kit einhergeht. Als Zweitlinientherapie stehen weitere Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Verfügung, die jedoch bislang nur mäßige Wirkung zeigen. Erschwerend kommt hinzu, dass die Wirksamkeit der Inhibitoren stark vom c Kit Genotyp abhängt. Das Verständnis der Protein-Interaktionsnetzwerke der c Kit Mutanten und des c Kit Wildtyps ist in diesem Zusammenhang essentiell. Zielsetzung dieser Arbeit war es, das Protein-Interaktionsnetzwerk von c Kit Wildtyp und ausgewählten GIST-assoziierten c Kit Mutanten genauer zu untersuchen. Dabei sollten bekannte Medikamenten-Zielmoleküle, wie z.B. Hsp90, genauer charakterisiert und neue potentielle Zielmoleküle gefunden werden. Die Identifizierung der Interaktionspartner erfolgte mit einer im Rahmen dieser Arbeit für c Kit Wildtyp etablierten expressions-entkoppelten Tandem-Affinitätsreinigung (u TAP). Als Modell für den stimulierten Zustand der Rezeptortyrosinkinase wurde in vitro phosphoryliertes c Kit Wildtyp Köderprotein im u-TAP Assay eingesetzt. Das Interaktionsnetzwerk von c Kit Wildtyp wurde in An- und Abwesenheit von Imatinib und des Hsp90 Inhibitors 17AAG untersucht. Beide Wirkstoffe hatten nahezu keinen Einfluss auf das Protein-Interaktionsnetzwerk von c Kit Wildtyp. Interaktionsanalysen der GIST-assoziierten c Kit Mutanten wiesen eine Bindung von Hsp90 und dessen Cochaperon Cdc37 nach, die beim Wildtyp nicht auftrat. Cdc37 gilt bereits als potentielles Medikamenten-Zielmolekül für verschiedene onkogene Proteine. Die Interaktion von Cdc37 mit c-Kit Mutanten wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals identifiziert und verifiziert. Darüber hinaus konnte eine vom Genotyp abhängige Affinität von c Kit zu Hsp90 und Cdc37 gemessen werden. Aufgrund der bekannten stabilisierenden Funktion von Hsp90 und Cdc37 erlaubt die Affinität Rückschlüsse auf die Stabilität einer Mutante und deren Sensitivität gegenüber Hsp90 Inhibitoren. c Kit Wildtyp degradierte in Anwesenheit von 17AAG deutlich weniger als die mit Hsp90 und Cdc37 interagierenden c Kit Mutanten. Die 17AAG-Sensitivität korrelierte für die meisten c Kit Mutanten mit der Affinität zu Hsp90 und Cdc37. Diese Genotyp-spezifische Sensitivität von c Kit gegenüber 17AAG könnte als Grundlage für eine individuelle GIST-Therapie dienen. Zusätzlich kann Cdc37 als potentieller neuer Angriffspunkt zur Behandlung von GIST betrachtet werden.

Translation of abstract (English)

Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are typically caused by a gain of function mutation in the receptor tyrosine kinase c Kit. GISTs can be successfully treated with the small molecule kinase inhibitor imatinib with response rates of up to 80-90 %. After approximately two years many patients develop resistance against imatinib, mostly due to a secondary mutation within c Kit. For second-line therapies several tyrosine kinase inhibitors are available, but so far less effective. Furthermore the response to kinase inhibitors is dependent on the c Kit genotype, which requires individual treatment. Essential in that context is an understanding of the protein-interaction networks of the c Kit mutants and of c Kit wild type. This work aimed to analyze protein-interaction networks of c Kit wild-type and selected GIST associated c Kit mutants. Established molecular drug targets like Hsp90 should be characterized in detail and novel drug targets identified. For the identification of the c Kit wild¬type interaction-network an expression-uncoupled tandem affinity purification (u TAP) assay was established. In vitro phosphorylated c-Kit wild-type bait protein was used as models for the ligand-stimulated state of c Kit. The effects of imatinib and of the Hsp90 inhibitor 17AAG on the c Kit wild-type interaction-network were analyzed in u-TAP assay, resulting in only moderate inhibitor effects. Analyzing the interaction networks of GIST associated c Kit mutants, a selective interaction with Hsp90 and its cochaperone Cdc37 was found, which did not show up for c Kit wild-type. Cdc37 is already described as a potential drug target for other oncogenic proteins. The interaction of c Kit mutants with Cdc37 was identified for the first time and could be verified. Furthermore c Kit genotype-specific interactions with Hsp90 and Cdc37 could be observed. Both Hsp90 and Cdc37 are known for their essential role in stabilizing mutated proteins. It was hypothesized that the c Kit genotype-specific affinities correlate with the stability of the individual c Kit mutant and hence with its 17AAG sensitivity. This could be confirmed as c Kit wild-type showed a considerably lower 17AAG-caused degradation than the degradation of mutated c-Kit, which also exhibited a higher affinity to Hsp90 and Cdc37. The differential Hsp90 and Cdc37 affinities of most mutated c Kit proteins correlate with their 17AAG sensitivities. The genotype-specific Hsp90 inhibitor sensitivities for c Kit imply the use of Hsp90 inhibitors for individual GIST treatment. The newly identified interaction partner of mutated c Kit, Cdc37, has the potential for a therapeutic target in GIST treatment.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Klingmüller, Prof. Dr. Ursula
Date of thesis defense: 4. May 2011
Date Deposited: 10. May 2011 11:10
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proto-Oncogen-Protein c-kit, Gist, Protein-Tyrosin-Kinasen, Protein-Protein-Wechselwirkung, Rekombinantes Protein, Hitzeschock-Proteine
Uncontrolled Keywords: uTAP-Assayc-Kit , GIST , Protein-protein interaction , u-TAP-Assay , heat shock proteins
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