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Differentielle DNA Methylierung und Analysen zum Transkriptionsfaktor hoxA9 in CD34+ hämatopoetischen Vorläuferzellen

Hellwig, Isabelle

English Title: Differential DNA Methylation and Analyses of hoxA9 in CD34+ hematopoietic progenitor cells

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PDF, German
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Abstract

Stammzellen definieren sich durch die duale Fähigkeit, sich einerseits selbst zu erneuern (Self-renewal) und andererseits verschiedene spezialisierte Zelltypen hervorbringen zu können (Differenzierung). Im Organismus sind vor allem adulte Stammzellen für die lebenslange Regeneration der verschiedensten Gewebe verantwortlich. Doch auch sie unterliegen, wie alle somatischen Zellen, dem Prozess der Alterung. Im Laufe der Zeit verlieren sie ihre Pluripotenz und die Fähigkeit zum Selbsterhalt. Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HPC) stellen die bis jetzt am besten charakterisierten und untersuchten adulten Stammzellen dar. Sie sind verantwortlich für die lebenslange Erneuerung des hämatopoetischen Systems und befinden sich in spezialisierten Nischen im Knochenmark. In diesem Zusammenhang wurde in dieser Arbeit die Hypothese untersucht, dass Gene, welche für die Selbsterneuerung von humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) notwendig sind, mit zunehmendem Alter und ihm Rahmen der Differenzierung durch DNA-Methylierung dauerhaft epigenetisch stillgelegt werden. Dazu wurden zunächst humane CD34+ HPC von Spendern verschiedener Altersgruppen (0 Jahre und 35 Jahre) und zudem differenzierte Granulozyten und Monozyten mittels spezifischer Oberflächenantigene isoliert. Von allen Proben wurde anschließend genomweit der Methylierungsstatus von 27.578 CpG Dinukleotiden aus den Promotorregionen von über 14.000 Genen per Infinium Human Methylation Bead Chip27 bestimmt und analysiert. Eine Validierung der Daten erfolgte mittels 454 Pyrosequenzierung. Insgesamt zeigen die Untersuchungen in den HPCs deutliche altersassoziierte Methylierungsunterschiede, die auch zu funktionellen Veränderungen führen können. Bei einer minimalen Methylierungsdifferenz von 15% weisen 192 CpG Dinukleotide eine deutliche Hypermethylierung, 350 CpG-Dinukleotide dagegen eine Hypomethylierung bei Erwachsenen im Vergleich zu Neugeborenen auf. Auch das Methylierungsmuster der myeloiden Differenzierungen, also der Vergleich von CD34+ HPCs zu Granulozyten und Monozyten, zeigt eine deutlich gerichtete Hypomethylierung im Vergleich zu undifferenzierten Stammzellen. Diese konnte durch Signalweganalysen auch in einen funktionellen Zusammenhang gestellt werden, was zeigt, dass myeloid assoziierte Gene im Laufe der Differenzierung demethyliert und dadurch aktiviert werden. Interessanterweise lassen sich zwischen den altersassoziierten Hypomethylierungen in den HPCs und der Hypomethylierung der myeloiden Differenzierung signifikante Übereinstimmungen finden, was darauf hinweist, dass die in der Literatur beschriebene myeloide Restriktion im Verlauf der Stammzellalterung auch auf dem Methylierungsmuster basiert. Dies wird zudem noch durch de novo Methylierungen im Vergleich der „jungen“ und „alten“ CD34+ Zellen untermauert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden einzelne Gene auf ihre Funktion und Regulation in hämatopoetischen Vorläuferzellen untersucht. Für den homeobox Transkriptionsfaktor und Onkogen hoxA9, der eine wichtige Rolle bei der Selbsterneuerung von hämatopoetischen Stammzellen und der Leukemogenese spielt, konnte eine sehr hohe Promotormethylierung in der leukämischen Zelllinie HL60 nachgewiesen werden. Diese korreliert mit einer sehr geringen hoxA9 Genexpression, wobei die Promotormethylierung durch demethylierende Agenzien herabgesetzt und die Expression reaktiviert werden kann. In primären Zellen konnten große Expressionsunterschiede von hoxA9 im Verlauf der hämatopoetischen Differenzierung gemessen werden, wobei die mRNA Menge des Transkriptionsfaktors im Laufe der myeloiden und lymphoiden Differenzierung kontinuierlich abnimmt. Funktionelle Effekte dieser Veränderungen auf das Selbsterneuerungsprofil der humanen HPCs wurden mittels Koloniebildenden Assays und siRNA Transfektionen untersucht. Diese zeigen deutlich, dass das Stammzellpotential der HPC durch eine reprimierte hoxA9 Genexpression reduziert wird. Dabei konnte allerdings kein Zusammenhang zu Alterung und Methylierung in gesunden primären Zellen hergestellt werden. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass HPCs im Rahmen der Alterung und Differenzierung molekularen und funktionellen Veränderungen unterliegen, welche zum Teil auf einer differentiellen DNA-Methylierung basieren. Ein genaueres Verständnis dieser molekularen Mechanismen der Alterung und der Genexpression in hämatopoetischen Stammzellen könnte zur Identifikation eventueller Risikofaktoren für Erkrankungen des Knochenmarks und zu innovativen Therapieansätzen, auch im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation, führen.

Translation of abstract (English)

Stem cells are defined by their dual ability to self-renew and to differentiate in various specialized cell types. Adult stem cells assure lifelong regeneration of adult tissues but just as all other cell types they underlie aging processes. Their capacity to proliferate and to self-renew diminishes. Hematopoietic stem and progenitor cells HPC) are the best analyzed and characterized adult stem cells so far. They give rise to all blood cells for the entire lifespan and reside in specialized stem cell niches. In this context we hypothesized that genes reuqired for self-renewal become silenced by DNA methylation with aging and differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells. Therefore we isolated human CD34+ hematopoietic progenitor cells of different donor ages (0 years, 35 years) and in addition we isolated differentiated Granulocytes and Monocytes. DNA-Methylation of all cells was measured by Infinium Human Methylation Bead Chip27 targeting 27.578 CpG sites located in promoter region of more than 14.000 genes. Data were validated by 454 pyrosequencing. Analyses of the HPC data show considerable age-associated methylation changes, which could induce functional alterations. By narrow methylation difference of 15% 192 CpG dinucleotides showed a signifianctly increased methylation a loss of methylation was measured at 350 CpG sites in older compared to young hematopoietic progenitor cells. During myeloid differentiation of HPC to granulocytes and monocytes a directed genomewide DNA-hypomethylation is detectable. By pathway analysis we could show the functional context of the adjusted methylation changes.Interestingly, the age-related hypomethylation showed high analogy with hypomethylation of myeloid differentiation-associated genes. These findings and also the de novo methylation events in “older” CD34+ cells suggest that epigenetic changes contribute to myeloid lineage restriction mentioned in hematopoietic stem cell aging. Furthermore we investigated the role of single genes in the hematopoietic system. The homeobox transcription factor and oncogene hoxA9 is mentioned to be important for self renewal of hematopoietic stem cells but also for the process of leukemogenesis. In the leukemic cell line HL60 we could detect a high level of hoxA9 promotor methylation which is correlated with low gene expression. This methylation level was reduced by treatment with demethylation-drugs and hoxA9 expression could be reactivated. In myeloid and lymphoid differentiation of healthy CD34+ hematopoietic progenitor cells we could detect a continuous decrease of hoxA9 expression. The functional importance of hoxA9 in self-renewal and differentiation could be pointed out by siRNA transfection and colony forming assays showing a decreased stemness for hematopoietic stem and progenitor cells by hoxA9 repression. However no connection to aging and methylation could be detected in healthy primary cells. In summary we could show that molecular and functional age- and differentiationassociated changes in HPC are based on differential DNA-methylation. Further understanding of the molecular mechanisms of aging and gene expression in hematopoietic stem cells will be important to identify epigenetic changes that confer a risk for development of bone marrow disease warranting therapeutic intervention.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Lyko, Prof. Dr. Frank
Date of thesis defense: 18 April 2011
Date Deposited: 16 May 2011 10:07
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Blutstammzelle
Uncontrolled Keywords: HSC , DNA-Methylierung , Stammzellalterung , DifferenzierungHSC , DNA-Methylation , stem cell aging , differentiation
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