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Konformation und Aktivität von Glucose Oxidase auf homogen beschichteten und nanostrukturierten Oberflächen

Seehuber, Andrea

English Title: Conformation and Activity of Glucose Oxidase on homogeneously coated and nano-structured surfaces

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PDF, German
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Abstract

Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Untersuchung der Aktivität und Sekundärstruktur von adsorbierter Glucose Oxidase (GOx). Das Enzym wird zum einen auf planare Gold- und Siliciumoberflächen abgeschieden, die zuvor mit verschiedenen Thiolaten bzw. Polyelektrolyten chemisch modifiziert wurden. Im Vergleich zum nativen Enzym in Lösung bleibt die enzymatische Aktivität der adsorbierten GOx auf positiv geladenen Oberflächen zu bis zu 80 % erhalten und sinkt auf aromatischen Oberflächen auf nur noch ca. 8 % des Referenzwertes. Die gemessenen spezifischen Aktivitäten der GOx sind umso niedriger, je niedriger der infrarotspektroskopisch quantifizierte Sekundärstrukturanteil an alpha-helicalen Elementen ist und je höher der Anteil an beta-Faltblattstrukturen im Vergleich zur nativen Struktur ist. Die GOx wird weiterhin auf Submonolgen von Goldnanopartikeln (AuNP) mit Durchmessern von 11 - 40 nm adsorbiert. Die AuNP werden mit den gleichen Thiolaten wie die planaren Goldoberflächen beschichtet und in eine proteinresistente Matrix eingebettet um eine Adsorption der GOx zwischen den AuNP zu verhindern. Die Aktivität der GOx ist auf allen AuNP-Filmen erheblich geringer als die des nativen Enzyms in Lösung sowie - unabhängig von der chemischen Natur der AuNP-Oberlfäche - auch geringer als die der GOx-Adsorbate auf den homogen beschichteten Substraten. Ursächlich hierfür ist hauptsächlich eine starke Denaturierung der adsorbierten GOx auf den AuNP, die mit einem hohen Anteil an beta-Faltblättern einhergeht. Zur großflächigen, nanoskaligen Strukturierung von Oberflächen wird auch die kolloidale Lithographie herangezogen. Mittels Gasphasenabscheidung eines oligo(ehtylenglykol)-terminierten Silans durch Monolagen aus Silica-Nanopartikeln auf Siliciumsubstraten können Ringstrukturen mit Durchmessern von 50 bzw. 100 nm präpariert werden, auf denen selektiv die Proteine BSA und Lysozym adsorbiert werden können. Begleitend zu den experimentellen Arbeiten werden das Adsorptionsverhalten von Polystyrol- und Silica-Nanopartikeln auf Gold- und Siliciumoberflächen auch theoretisch untersucht. Durch Zugabe von NaCl zur Partikelsuspension kann das repulsive Potential zwischen den Partikeln und den Substraten so weit abgeschirmt werden, dass die Partikel als statistisch dicht gepackte Monolage auf ein planares Substrat adsorbieren. Die Menge an NaCl, die hierfür benötigt wird, ist dabei abhängig vom Partikelradius sowie den Oberflächenladungen und Hamaker-Konstanten der verwendeten Materialien. Es werden die Wechselwirkungspotentiale bestehend aus einem attraktiven van-der-Waals-Term, einem repulsiven Coulomb-Term sowie einem repulsiven Born-Term für verschiedene Partikel-Substrat-Kombinationen berechnet. Die Übereinstimmungen mit den experimentellen Ergebnissen sind sehr gut.

Translation of abstract (English)

This work focuses on the investigation of the activity and secondary structure of adsorbed Glucose Oxidase (GOx). Therefore, the enzyme is adsorbed onto planar gold and silicon surfaces that are chemically modified by means of various thiolate and polyelectrolyte coatings. Compared to the native enzyme in aqueous solution the enzymatic activity of adsorbed GOx is preserved up to 80 % on positively charged surfaces and drops to only 8 % of the reference value on aromatic surfaces. Hereby, a decrease of specific activity of the adsorbed GOx can be correlated with the degree of breakup of alpha-helica elements and an increasing amount of beta-sheets as determined via infrared spectroscopy. Furthermore, the behavior of GOx is studied after adsorption onto sub-monolayers of gold nanoparticles (AuNP) with a diameter of 11 - 40 nm. Analogues to the planar surfaces, the AuNP sub-monolayers were coated with thiolates and subsequently embedded into a protein resistant matrix to inhibit protein adsorption in between the AuNP. Remarkably, the activity of GOx on all AuNP films is shown to be lower than the activity of the native enzyme in solution. In addition, irrespective of the AuNP's chemical coating, the activity of the GOs is lower compared to the GOx adsorbates on planar surfaces. The low enzymatic activity can be correlated with a high degree of unfolding coinciding with a large quantitative fraction of beta-sheets. Additionally, colloidal lithography is applied to facilitate large-area nano-structuring of surfaces. Ring sturctures with a diameter of 50 and 100 nm, respectively, are prepared by means of vapor phase deposition of an oligo(ethylene glycol)-terminated silane through monolayers of silica particles on silicon substrates. BSA and Lysozyme can be selectively adsorbed onto these ring structures. Concomitantly, the adsorption behavior of polystyrene and silica nanoparticles is studied in theory. The formation of random closed packed particle monolayers is achieved by addition of NaCl to the particle suspension, whereby NaCl screens the repulsive potentials between the particles and substrates. The required amount of NaCl depends on the particles' as well as the surface charges and the Hamaker constants of the particular materials. The interaction potentials consisting of an attractive van-der-Waals term, a repulsive Coulomb term and a repulsive Born term are calculated and found to be in good agreement with the experiments.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dahint, Dr. [apl.] Reiner
Date of thesis defense: 13. May 2011
Date Deposited: 20. May 2011 11:24
Date: 2011
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Immobilisiertes Enzym, Nanopartikel, Sekundärstruktur
Uncontrolled Keywords: Glucose Oxidaseimmobilized enzyme , nanoparticle , secondary structure
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