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Untersuchungen der Dynamik von Nukleosomen mittels Einzelmolekülfluoreszenz

Böhm, Vera

English Title: Unraveling nucleosome dynamics using single molecule fluorescence

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PDF, German
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Abstract

DNA ist der Speicher der genetischen Information. In Eukaryoten ist die DNA in Nukleosomen organisiert, d.h. kurze DNA-Abschnitte sind zweimal um einen Kern aus Histonproteinen gewunden. Die Nukleosomen beeinflussen die zelluläre Maschinerie, die die genetischen Informationen abliest. Dass zu jeder Zeit die passende Information auf der DNA zugänglich ist, wird unter anderem durch die Dissoziation und die Assemblierung von Nukleosomen reguliert. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um diese Prozesse in vitro zu analysieren. Dazu wurden Nukleosomen sowohl an verschiedenen Histonen als auch an der DNA mit Fluorophoren markiert und mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (spFRET) in einem konfokalen Mikroskop untersucht. Durch Variation der Ionenstärke wurde dabei die Dissoziation und die Assemblierung der Nukleosomen induziert. Mittels FCS wurde aus Fluktuationen der Fluoreszenzintensität der Diffusionskoeffizient von Nukleosomen ermittelt. Da der Diffusionskoeffizient ein Maß für die Größe und Form eines Moleküls ist, konnte durch dessen Änderung die Dissoziation von Nukleosomen verfolgt werden. So wurde gezeigt, dass der Proteinkern schrittweise von der DNA abdissoziiert und substöchiometrische DNA-Histon-Komplexe als Zwischenprodukte auftreten, in denen die DNA für die zelluläre Maschinerie leichter zugänglich ist. FRET ist ein Prozess, bei dem Energie strahlungslos zwischen zwei Fluorophoren übertragen wird. Aus der Emission der Fluorophore lassen sich deren Abstände in Molekülen untersuchen. In dieser Arbeit wurde Energietransfer in einzelnen durch das Fokusvolumen diffundierenden Nukleosomen gemessen. Im Vergleich zu Messungen an Molekülensembles, bei denen der Interfluorophorabstand über alle Nukleosomen gemittelt wird, konnten so verschiedene Zustände identifiziert werden, die sich im Interfluorophorabstand unterscheiden. Auf diese Art konnte eine bislang unbekannte Nukleosomkonformation nachgewiesen werden, die vor der Dissoziation der Histone von der DNA auftritt, und in der die Histone und die DNA leichter für externe Faktoren zugänglich sind. Auch konnte gezeigt werden, dass bei der Assemblierung von Nukleosomen die gleichen Zwischenprodukte in umgekehrter Reihenfolge durchlaufen werden, und der Prozess vollständig reversibel ist. In vivo wird die Stabilität der Nukleosomen unter anderem durch den Austausch von Histonen durch Histonvarianten reguliert. In dieser Arbeit wurde mit spFRET der Einfluss einer Histonvariante (H2A.Z) untersucht und es wurde gezeigt, dass bei der Dissoziation von Nukleosomen, die diese Histonvariante enthalten, andere Zwischenprodukte auftreten. Die Histonvariante kann daher signifikante Auswirkungen auf die Zugänglichkeit der DNA haben.

Translation of abstract (English)

DNA contains the genetic instructions used for the development and function of all living organisms. In eukaryotes, a large amount of DNA must be compacted into the volume of nucleus; this is accomplished by wrapping short fragments of DNA around a core of histone proteins forming a complex called nucleosome. These nucleosomes, however, represent an obstacle for the cellular machinery that reads the genetic information. To regulate which information is read out at any given time, the cell can assemble or disassemble specific nucleosomes at the loci of interest. In this thesis, an in vitro assay for the investigation of these regulatory processes has been developed. For the assay, nucleosomes were fluorescently labeled on different positions within the histone core, as well as along the DNA. They were then analyzed by confocal microscopy using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and single pair Förster Resonance Energy Transfer (spFRET) while assembly and disassembly was induced by varying the ionic strength of the medium. FCS can be used to measure the diffusion coefficient by analyzing fluctuations in fluorescence emission as the molecules move through the confocal spot. As the diffusion coefficient is a measure for the molecule’s size and shape, distinct (dis)assembly steps could be observed using FCS showing that the histone core disassembles sequentially and sub-stoichometric histone-DNA complexes arise where the DNA becomes more accessible to the cellular machinery. While step-wise (dis)assembly proved to be an interesting finding, intermediate states within this pathway were further probed using spFRET. FRET is the non radiative energy transfer between two fluorophores. Its efficiency depends highly on the fluorophores’ distance which can thus be investigated. Compared to bulk analysis, spFRET experiments can unravel specific subpopulations of heterogeneous samples that differ in distance between their fluorescently labeled components. In this thesis a previously uncharacterized structural state was observed, in which the histones become more accessible to the cellular machinery prior to dissociation from the DNA. This intermediate state is populated at 0.2 – 6 % under physiological conditions. In vivo, the stability of nucleosomes is regulated by exchanging major type histones for histone variants. To characterize the role of histone variants in nucleosome accessibility, major-type H2A was replaced with histone variant H2A.Z in nucleosomes, and its effect on nucleosome (dis)assembly and open-state formation was investigated. Strikingly, spFRET data analysis shows nucleosomes containing H2A.Z follow a (dis)assembly pathway distinct from nucleosomes containing major-type histones, which also contains new, yet to be identified, intermediate states.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Prof. Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 6 May 2011
Date Deposited: 25 May 2011 14:28
Date: 2011
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Dekanat der Fakultät für Chemie und Geowissenschaften
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: nucleosome dynamics , DNA , fluorescence , FRET
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