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Characterization of the RNA binding protein RBP10 in Trypanosoma brucei

Wurst, Martin

German Title: Charakterisierung des RNA bindenden Proteins RBP10 in Trypanosoma brucei

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Abstract

Trypanosoma brucei is the causative agent of the African sleeping sickness. Between mammalian hosts it is transmitted by the tsetse fly. Due to the different environments of the hosts the parasite has to adapt its metabolism quickly. T. brucei RNA polymerase II lacks transcriptional control; therefore the control of gene expression is exerted mainly at the level of mRNA stability and translation. RNA stability is influenced by the binding of RNA binding proteins (RBPs), which thereby can play a crucial role in gene expression. This work focused on the characterization of the RNA binding protein RBP10. A polyclonal antibody was raised which showed that RBP10 is only expressed in the BS of the parasite. A knockdown of RBP10 by RNAi in the bloodstream form (BS) of the parasite was lethal after four days. Microarray studies comparing RBP10 knockdown RNA to BS WT RNA revealed a widespread effect on the transcriptome with many BS-specific mRNAs decreased, including many mRNAs encoding proteins involved in glucose metabolism. Further, the effect of the inhibition of glucose uptake by phloretin treatment on the transcriptome was explored and compared to the effect of RBP10 RNAi. The ectopic expression of RBP10-myc in the PC resulted in a defect in proliferation and also in the expression of endogenous RBP10. Microarray studies showed that in the PC the artificial expression of RBP10 lead to a strong increase of many BS specific mRNAs and a simultaneous decrease of PC specific mRNAs. It could also be shown that the forced expression of RBP10 inhibited differentiation of BS to PC trypanosomes. Putative direct RNA targets were identified by IP with subsequent purification of bound RNA and deep-sequencing. However, these results do not overlap with the mRNAs affected after RPB10 RNAi. Also using IP probable protein interaction partners were detected revealing among others RBP29, which is known to be on polysomes, and PABP2. In a sucrose gradient RBP10 was not found in the fractions of the heavy polysomes but could be detected in fractions of the free proteins to the fractions of proteins in trisomes. These findings show that RBP10 is necessary for the expression of many BS specific mRNAs.

Translation of abstract (German)

Trypanosoma brucei ist der Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit. Die Parasiten werden von der Tsetse Fliege zwischen den menschlichen Wirten übertragen. Deshalb ist es notwendig, dass sie ihren Stoffwechsel schnell an neue Umgebungen anpassen können. Allerdings verfügen diese Parasiten über keine transkriptionelle Kontrolle der Genexpression, weshalb die Kontrolle über Translation und die Stabilität der RNA sehr wichtig sind. Die Lebensdauer einer RNA wird bestimmt durch RNA-bindende Proteine, die daher eine entscheidende Rolle in der Genexpression einnehmen. In dieser Arbeit wird das RNA bindende Protein RBP10 charakterisiert. Mit Hilfe eines polyklonalen Antikörpers konnte gezeigt werden, dass RBP10 ausschließlich in der Blutstromform (BS) des Parasiten exprimiert wird und eine Reduktion der Proteinmenge für den Parasiten letal ist. Microarray Analysen ergaben dass RBP10 notwendig für die Expression vieler BS spezifischen mRNAs ist, darunter sind viele mRNAs die für Proteine der Glykolyse kodieren. Deshalb wurde der Effekt von Phloretin, das die Aufnahme von Glukose in die Zellen verhindert, ebenfalls mittels Mikroarray Analyse untersucht und mit den Daten der RBP10 Reduktion verglichen. Eine Expression von RBP10 in Zellen im prozyklischen Stadium hatte eine Verringerung der Wachstumsrate zur Folge. Zudem wurden viele BS spezifische mRNAs verstärkt exprimiert. Eine Expression von RBP10 in BS Trypanosomen verhinderte zudem die Differenzierung in das prozyklische Stadium. Durch die Isolierung von an RBP10 gebunden RNAs und deren Sequenzierung konnten potentielle Ziele von RBP10 identifiziert werden. Allerdings konnte keine Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Mikroarray Analyse gefunden werden. Mögliche Bindungspartner von RBP10 konnten mittels Massenspektroskopie ermittelt werden. Unter anderem wurde RBP29, welches in Polysomen gefunden wurde, wie auch PABP2 identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass RBP10 für die Expression für viele BS spezifische mRNAs benötigt wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Clayton, Prof. Dr. Christine
Date of thesis defense: 31. May 2011
Date Deposited: 07. Jun 2011 14:57
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Messenger-RNS, Transkriptomanalyse, Transkriptom, Zelldifferenzierung, RNS-Bindungsproteine, Trypanosoma brucei, Trypanosoma brucei brucei
Uncontrolled Keywords: RRM motif
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