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Functional characterization of the vertebrate-specific presynaptic protein Mover in the calyx of Held

Körber, Christoph

German Title: Funktionelle Charakterisierung des vertebratenspezifischen präsynaptischen Proteins Mover im Held’schen Calyx

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Abstract

Signal transduction at chemical synapses in the central nervous system relies on the tightly regulated release of neurotransmitter from the active zone of the presynaptic compartment. Although key components of the machinery responsible for transport, docking, priming and fusion of synaptic vesicles have been identified, our understanding of the regulation of this complex process is still incomplete. This is especially true for the probability of release, which determines whether or not one or more synaptic vesicles get released upon arrival of an action potential at the active zone. Albeit the probabilistic nature of neurotransmitter release is one of the key features underlying higher order brain functions such as learning and memory, the mechanisms that regulate this process remain largely elusive. In the present study, we examined the functional properties of the recently identified presynaptic vertebrate-specific protein Mover. Therefore, we generated an in vivo knock-down of Mover using adeno-associated virus mediated shRNA expression in the globular bushy cells of the ventral cochlear nucleus, the projection neurons forming the calyx of Held. 3D immunohistochemistry 10 days after virus injection at postnatal day 2, revealed a strong reduction of Mover expression in identified single calyces expressing mOrange in cis with the shRNA. Electrophysiological characterization of Mover knock-down synapses at postnatal days 12 and 13 revealed increased EPSC amplitudes, increased and accelerated short-term depression and increased recovery from depression as compared to controls. Contrarily, spontaneous release properties, EPSC kinetics, readily-releasable pool size and synaptic vesicle mobilization were not affected by Mover knock-down. These findings are in line with an increased probability of release after Mover knock-down. The increase in release probability was confirmed by presynaptic capacitance recordings in which near-maximal release in Mover knock-down calyces was achieved with shorter depolarization steps as compared to controls. Presynaptic calcium currents were not affected by Mover, assuring that the increase in release probability was not due to alterations in calcium influx. Thus, we examined the calcium sensitivity of release in Mover knock-down synapses by monitoring the EPSC amplitude in different extracellular calcium concentrations. In these experiments, we found EPSC amplitudes in 1.5 mM extracellular calcium significantly increased upon knock-down of Mover suggesting that Mover indeed decreased the calcium sensitivity of release. In summary, our findings show that Mover acts as a negative regulator of release probability, most likely by reducing the calcium sensitivity of release. Taking the previously shown expression pattern of Mover in certain subsets of synapses into account, Mover may constitute a novel mechanism to tune synaptic transmission.

Translation of abstract (German)

Die Signalübertragung an chemischen Synapsen im zentralen Nervensystem beruht auf der regulierten Freisetzung von Botenstoffen, so genannten Neurotransmittern, an spezialisierten „aktiven Zonen“ innerhalb der präsynaptischen Plasmamembran. Obwohl große Teile der zur Vesikelfreisetzung führenden Proteinmaschinerie bekannt sind, ist die Regulation dieses komplexen Prozesses nur unvollständig verstanden. Im Besonderen gilt dies für die Regulation der Freisetzungswahrscheinlichkeit die bestimmt, ob ein oder mehrere synaptische Vesikel mit der Plasmamembran fusionieren und somit Neurotransmitter freisetzen, wenn ein Aktionspotential die aktive Zone erreicht. Der probabilistische Prozess der Vesikelfreisetzung ist der eine der Grundlagen höherer Hirnfunktionen wie Lernen und Gedächtnis. Trotzdem sind seine regulativen Mechanismen bis heute nur in Ansätzen verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden die funktionellen Eigenschaften des vor kurzem identifizierten Protein Mover untersucht. Mover wird in der Präsynapse definierter Synapsenpopulationen exprimiert und ist spezifisch für Vertebraten. Um Einblicke in die bislang unbekannte Funktion von Mover zu erhalten generierten wir einen zellspezifischen in vivo knock-down von Mover in den globular bushy cells des Nucleus cochlearis ventralis. Diese Projektionsneurone bilden den Held’schen Calyx, eine Riesensynapse im medialen Kern des Trapezkörpers im auditorischen Hirnstamm, aus. Hierzu wurden adeno-assoziiert Vieren die für eine gegen die mRNA von Mover gerichtete shRNA sowie das fluoreszierende Reporterprotein mOrange kodierten in den Nucleus cochlearis ventralis zwei Tage alter Ratten injiziert. Die Expression von Mover war zehn Tage nach der Injektion der Vieren stark reduziert, wie eine immunhistochemische Kontrolle des knock-down ergab. Dabei wurden shRNA exprimierende Calyces an Hand der Expression von mOrange identifiziert. Die elektrophysiologische Charakterisierung von knock-down Calyces ergab, dass die Reduktion von Mover zu einer Erhöhung der postsynaptischen Stromamplitude, einer schnelleren und vollständigeren Kurzzeitermüdung sowie einer schnelleren Erholung von dieser Ermüdung führte. Die Eigenschaften der spontanen Vesikelfreisetzung, die Kinetiken der postsynaptischen Ströme, die Anzahl der sofort freisetzbaren Vesikel und die Mobilisierung der Vesikel dagegen waren unabhängig von Mover. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Mover eine Reduzierung der Freisetzungswahrscheinlichkeit bewirkt. Messungen der Kapazität der präsynaptischen Membran bestätigten diesen Befund, da in knock-down Synapsen bereits kurze Depolarizationen ausreichten um eine nahezu maximale Freisetzung von Vesikeln zu erreichen. Dieser Effekt wurde nicht durch einen größeren Kalziumeinstrom in Mover knock-down Synapsen verursacht, da die präsynaptischen Kalziumströme durch Mover nicht beeinflusst wurden. Wir untersuchten daher die Kalziumsensitivität der Freisetzung, da eine Erhöhung der Kalziumsensitivität die höhere Freisetzungswahrscheinlichkeit in Mover knock-down Synapsen erklären könnte. Dazu wurde die postsynaptisch Stromamplitude bei unterschiedlichen extrazellulären Kalziumkonzentrationen untersucht. Wir fanden eine Erhöhung der postsynaptischen Stromantworten bei 1,5 mM extrazellulärem Kalzium in knock-down Synapsen, was darauf hindeutet, dass Mover in der Tat die Kalziumsensitivität der Freisetzung herabsetzt. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass Mover, vermutlich durch die Herabsetzung der Kalziumsensitivität der Freisetzung, die Freisetzungswahrscheinlichkeit synaptischer Vesikel verringert. Zusammen mit dem bereits publizierten Expressionsmuster von Mover in spezifischen Populationen von Synapsen, lassen unsere Ergebnisse vermuten, dass Mover Teil eines neuen Mechanismus zur Feineinstellung der Effizienz der synaptischen Transmission ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kuner, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 15 June 2011
Date Deposited: 27 Jun 2011 13:35
Date: 2011
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Anatomie und Zellbiologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Synapse
Uncontrolled Keywords: Held'scher Calyx , Neurotransmitterfreisetzung , präsynaptischsynaptic transmission , calyx of Held , synaptic release , presynaptic
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