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The cell and molecular biological characterization of cell-cell junctions in mammalian heart valves

Barth, Mareike

German Title: Die zell-und molekularbiologische Charakterisierung der Zell-Zell-Kontakte in Säugerherzklappen

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Abstract

In view of the large proportion of cardiac cells represented by interstitial mesenchymal cells, in particular in the valves, of the frequency and importance of valve surgery, notably replacements, and of the numerous “tissue engineering” projects to provide artificial valve structures it is actually surprising to see how limited the cell and molecular biological knowledge of valvular interstitial cells (VICs) still is. Surprisingly, the molecular components of the special adherens junctions (AJs) of VICs have not yet been elucidated to a satisfying degree. Therefore, the AJs of adult and fetal VICs of human and animal (bovine, ovine and porcine) heart valves have been studied in situ and cell culture preparations, using light and electron microscopy, including immunolocalization techniques, protein as well as glycoprotein analysis by SDS-PAGE, followed by identification of the separated molecules using immunoblotting. In my thesis I could show that adult mammalian VICs in situ possess cell-cell adhering junctions only of the puncta adhaerentia AJ-type, comprising N-cadherin and cadherin-11 as constitutive transmembrane glycoproteins, anchored in cytoplasmic plaques containing α- and β-catenin, plakoglobin, proteins p120 and p0071 which are accompanied by actin-binding proteins such as afadin, vinculin, α-actinin and proteins ZO 1-3. In two-dimensional (2D) cell cultures of adult mammalian VICs of different species, this rather simple molecular AJ ensemble was surprisingly found to be modified by the acquisition of the desmosomal plaque protein plakophilin-2, in the total absence of desmosomal structures and other desmosomal proteins. In three-dimensional (3D) culture constructs mimicking a native valve matrix environment, it could be shown that AJ-plakophilin-2 gradually decreased or was even lost but was able to re-assemble when VICs were re-isolated from 3D constructs and grown in 2D culture again. Human and porcine fetal VICs in situ also presented plakophilin-2 in their AJs, showing that the phenomenon of plakophilin-2 acquisition is not an artefact of cell culture conditions. Primary cultures of porcine fetal VICs also revealed adventitious plakophilin-2. Even more surprisingly fetal endothelial cells of the endocardium – but only those located at the valves and not those at the myocardium – also displayed the addition of this desmosomal protein to their AJ plaques, whereas those of other regions of fetal vascular endothelia remained negative for this protein. Again unexpectedly, pathologically altered cells of adult heart valves, showing an elevated proliferative activity, did not present plakophilin-2 in their AJs. Such as fetal VICs showed only relatively low proliferative activity, these findings may lead to the hypothesis that the acquisition of plakophilin-2 might be rather the result of a general activation- than a proliferation-induced event. Correspondingly, an alternative concept for early valvulogenesis is proposed, differering from the presently prevailing “epithelial- (here better: endothelial-) mesenchymal-transition” (EMT) hypothesis, which is based on the assumption of an ab initio presence of mesenchymal cells of the VIC type, even in the early heart tube “anlage”. The advent of a single desmosome-typical protein, plakophilin-2, in VICs of fetal heart valves and in culture is not an isolated phenomenon as it fits in phenomena observed in recently identified forms of plakophilin-2-containing AJs (coniunctiones adhaerentes) found in other mesenchymal cells such as bone marrow-derived stem cells, malignantly transformed mesenchymal cell lines and certain soft tissue tumors. It is obvious that a more detailed characterization of VICs, notably their AJs, will be needed to provide a safe basis for replacement valve surgery using structures formed by cells grown in valvular cell cultures in vitro.

Translation of abstract (German)

In Anbetracht des hohen Anteils mesenchymaler Interstitialzellen an der Gesamtmenge der Zellen des Herzens, besonders in Klappen, der Häufigkeit und Wichtigkeit von Herzklappen-Operationen, vor allem auch von Klappenersatz-Eingriffen, und der zahlreichen „Tissue Engineering“-Projekte zur Herstellung artifizieller Herzklappenkonstrukte, ist es sehr erstaunlich zu sehen, wie begrenzt der zell- und molekularbiologische Wissensstand über valvuläre Interstitialzellen (VICs) immer noch ist. Überraschenderweise sind besonders die molekularen Komponenten der speziellen Adhärenz-Verbindungen (AJs) der VICs weitgehend unbekannt geblieben. Daher wurden die AJs adulter und fötaler VICs sowohl aus humanen und tierischen (Rind, Schaf und Schwein) Herzklappen in situ und in Zellkulturansätzen mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden, vor allem auch Immunlokalisierungstechniken, sowie durch Protein- und Glykoprotein-Analysen in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Identifizierung der aufgetrennten Moleküle durch Antikörper-Bindung, untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass die VICs adulter Säuger in situ ausschließlich AJ-Verbindungen des puncta adhaerentia-Typs besitzen. Darin sind die konstitutiven Transmembran-Glykoproteine N-Cadherin und Cadherin-11 in zyto-plasmatischen „Plaques“ verankert, die α- und β-Catenin, Plakoglobin, die Proteine p120 und p0071 sowie eine Reihe von Aktin-bindenden Proteinen wie Afadin, Vinculin, α-Aktinin und die Proteine ZO-1-3 enthalten bzw. enthalten können. In zwei-dimensionalen Zellkulturen adulter Säuger-VICs verschiedener Spezies ist dieses relativ einfache AJ-Molekül-Ensemble überraschenderweise durch das Hinzukommen des desmosomalen Plaque-Leitproteins Plakophilin-2, verändert, wobei jedoch desmosomale Strukturen und andere desmosomen-spezifische Moleküle fehlen. In drei-dimensionalen Kulturen, welche die natürliche Matrix-Umgebung der Herzklappe imitieren, konnte dann gezeigt werden, dass sich darin die Menge an AJ-Plakophilin-2 allmählich verringert oder sogar ganz verschwinden kann, dann aber in aus solchen Konstrukten wiedergewonnenen Zellkulturen wieder nachgewiesen werden kann. In menschlichen wie auch in vom Schwein stammenden fötalen VICs konnte in situ ebenfalls Plakophilin-2 als Bestandteil ihrer AJs nachgewiesen werden, was beweist, dass es sich bei dem Phänomen der Plakophilin-2-Akquisition nicht um einen Zellkultur-Artefakt handelt. Noch überraschender war jedoch die Entdeckung, dass fötale Endothelzellen de Endokards – allerdings nur solche im Bereich von Klappen, aber nicht solche, die an das Myokard grenzen – ebenfalls Plakophilin-2 enthielten, wobei dieses Protein in den AJs der Endothelien anderer Blutgefäße nicht vorkam. Unerwartet war dann wiederum die Beobachtung, dass Zellen pathologisch veränderter Herzklappen mit erhöhter Zellproliferation kein Plakophilin-2 in ihren AJs aufwiesen. Da auch fötale VICs nur noch eine relativ geringe Teilungsaktivität aufweisen, führen diese Befunde zur Vermutung, dass das Hinzukommen von Plakophilin-2 in AJs eher das Ergebnis eines allgemeinen Aktivierungs- als das eines Proliferations-Prozesses an sich ist. In diesem Zusammenhang sollte man – alternativ zur bisherigen Hypothese der „Epithelial- (hier eher zutreffend: Endothelial-) Mesenchymalen-Transition“ (EMT) – das Konzept einer ab initio Präsenz des VIC-Zelltyps schon in der frühen Entwicklung der Herzklappe in Erwägung ziehen. Das isolierte Auftreten eines einzelnen desmosomen-spezifischen Proteins, Plakophilin-2, in den AJs fötaler VICs in situ sowie auch in Zellkultur gehaltener VICs ist übrigens kein isoliertes Phänomen, sondern wurde jüngst ebenfalls in anderen mesenchymalen Zellen wie z.B. in Kulturen von „Stammzellen“ aus dem Knochenmark, tumorös transformierten mesenchymalen Zellkulturen sowie in bestimmten Weichteil-Tumoren gefunden und als neuartige, Plakophilin-2-haltige Adhärenzverbindung (coniunctio adhaerens) beschrieben. Diese Beobachtungen machen deutlich, dass gerade als Basis für die Erforschung und Herstellung von Klappenersatz-Konstrukten, die auf in Kultur gewachsenen VICs oder ähnlichen Zelltypen basieren, eine detaillierte Charakterisierung der Zellen, besonders ihrer Zell-Zell-Verbindungen, erforderlich ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Franke, Prof. Dr. Werner W.
Date of thesis defense: 14 June 2011
Date Deposited: 28 Jun 2011 09:49
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Herzklappe
Uncontrolled Keywords: Interstitialzellen , Zell-Zell-Kontakte , Plakophilin-2heart valve , interstitial cells , cell-cell-contacts , plakophilin-2
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