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Funktionelle Charakterisierung der potenziellen Rolle des „Nonsense-mediated mRNA Decay“ (NMD)-Proteins „Up-Frameshift 1“ (UPF1) in der Translation

Kerschgens, Kathrin Simone

English Title: Biochemical characterisation of the potential role of the „nonsense-mediated mRNA decay“ (NMD)- protein „up-frameshift 1“ (UPF1) in translation

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PDF, German
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Abstract

„Nonsense-Mediated mRNA Decay“ (NMD) ist ein translationsabhängiger Qualitätskontroll-mechanismus der post-transkriptionalen Genexpression in Eukaryonten. Durch NMD werden mRNAs mit vorzeitigen Stopkodons im offenen Leserahmen (ORF) erkannt und abgebaut, was durch die NMD-Effektorproteine UPF1, UPF2 und UPF3b vermittelt wird. Der Abbau aberran-ter mRNAs wird durch die vorzeitige Termination der Proteintranslation ausgelöst. Die dieser Funktion zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und insbesondere die Rolle der UPF-Proteine sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die auf die Interaktion des NMD-Faktors UPF1 mit den Translations-Terminationsfaktoren eRF1 und eRF3 folgende Phosphorylierung von UPF1 durch SMG1 scheint ein Schlüsselereig-nis zur Auslösung des Degradationsmechanismus zu sein. Es ist jedoch unbekannt, durch welche Abläufe hier zwischen normaler und vorzeitiger Termination unterschieden wird. Eine lange 3’-UTR, sowie ein „Exon-Junction-Complex“ (EJC) mehr als 22 Nukleotide stromabwärts des Terminationskodons dienen als Erkennungskriterien von NMD-Substraten. Daten aus S. cerevisiae deuten darauf hin, dass die Termination oder das Recycling der Ribosomen bei der Translation von NMD-Substraten aberrant ist. Die Grundhypothese der hier vorliegenden Arbeit postuliert, dass UPF1 durch seine Interak-tion mit dem Translationsapparat hier im Zentrum eines kinetischen Proofreading-Mechanismus steht, durch den die verschiedenen positiven (Nähe des Terminationsereignis-ses zum Poly-(A)-Schwanz und PABPC1) und negativen (EJC in der 3’-UTR) Terminationssigna-le integriert werden. UPF1 könnte also eine generelle Rolle bei der Termination spielen. Au-ßerdem wurde UPF1 in der Literatur eine negative regulatorische Rolle in der Translationsinitiation zugewiesen. Um die Rolle von UPF1 bei der Translation genauer aufzuschlüsseln, wurde hier ein aus HPLC-gereinigten Faktoren rekonstituiertes in vitro Translationssystem adaptiert. Durch Analyse in vitro assemblierter Translationskomplexe konnte ich feststellen, dass die Assemblierung von 48S-Initiationskomplexen, die Bindung der ribosomalen 60S-Untereinheit, die Elongation und die Termination der Translation sowie das Recycling der Ribosomen unabhängig von der An- oder Abwesenheit von UPF1 effizient ablaufen. In einem modifizierten Ansatz modulierte UPF1 in Gegenwart von geringen Mengen an Ter-minationsfaktoren die Dissoziation von aus Retikulozytenlysat gewonnenen Terminationsin-termediaten. Die hier vorgestellte Arbeit deutet auf eine Rolle von UPF1 bei der Feinabstim-mung der Translationstermination oder dem Recycling der Ribosomen nach der Termination im Kontext des mRNPs hin. Neben diesen Implikationen für den Translationsmechanismus im Allgemeinen könnten die hier gewonnenen Daten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von NMD leisten.

Translation of abstract (English)

Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) in human cells is a translation-dependent mRNA quality control process. NMD recognizes and degrades mRNAs with premature termination codons in the open reading frame (ORF), a process that is mediated by the UPF proteins sensing the correct position of the termination codon relative to the exon-intron structure of the mRNA. Premature termination of protein translation triggers degradation of the respective mRNA. The underlying molecular mechanisms that lead to the translation-dependent recognition of mRNAs with premature termination codons and their subsequent degradation and especially the role of the UPF proteins remain to some extent unclear. UPF1 (“up-frameshift 1”) represents one of the key NMD proteins that has been shown to interact with the eukaryotic translation initiation factor eIF3 and termination factors eRF1 and eRF3. Following interaction with translation termination factors eRF1 and eRF3, phos-phorylation of UPF1 by its kinase SMG1 is thought to be a key event to trigger the degrada-tion mechanism. It is jet unknown which course of events distinguishes between normal and premature termination. Long 3-UTRs and EJCs more than 22nt downstream of the termina-tion codon are key features of NMD substrates. Data from yeast indicate that translation termination or ribosome recycling of NMD substrates is aberrant. The central hypothesis of the work presented here postulates that through its interaction with the translation apparatus, UPF1 stands in the center of a kinetic proofreading mechan-ism that integrates positive (spacial proximity of the termination event to the poly (A)-tail and PABPC1) and negative (EJC in the 3-UTR) termination signals. UPF1 could thus play a general role in the termination process. Moreover, in the literature, UPF1 has been assigned a negative regulatory function in translation initiation. To better understand the potential role of UPF1 in translation, I adapted a eukaryotic in vitro translation system that is reconstituted from purified components. Through biochemical analysis of in vitro assembled translation complexes, I found that the assembly of 48S initia-tion complexes, 60S subunit joining, elongation, termination and ribosome recycling pro-ceeded efficiently irrespective of the presence or the absence of UPF1. In a modified approach, UPF1 modulated the dissociation of reticulocyte lysate-purified ter-mination intermediates in the presence of low amounts of termination factors. The work presented here may indicate a role of UPF1 in the finetuning of translation termination or ribosome recycling in the context of the mRNP. Apart from implications on the mechanism of translation in general, these data might help to elucidate the mechanism of PTC recognition during NMD.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Nickel, Prof. Dr. Walter
Date of thesis defense: 27 May 2011
Date Deposited: 29 Jun 2011 14:11
Date: 2011
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Universitätskinderklinik
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: RNS-Stoffwechsel, Helicasen, Messenger-RNS
Uncontrolled Keywords: UPF1 , NMD , mRNAUPF1 , NMD , mRNA
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