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The formation of endoplasmic reticulum-plasma membrane contact sites in mammalian cells

Ercan, Ebru

German Title: Die Bildung von Endoplasmatischen Retikulum-Plasmamembran Kontaktstellen in Säugetierzellen

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PDF, English (Ebru Ercan Dissertation)
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Abstract

Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist in seiner Morphologie verschiedenartig. Es setzt sich aus plattenförmigen und tubulären Strukturen zusammen. Die verschiedenen Domänen des ERs erfüllen vielfache Funktionen u.a. in der kotranslationalen Proteintranslokation, der Lipidsynthese, der Qualtitätskontrolle und dem Protein- und Lipidtransport zu unterschiedlichen Organellen. Das ER steht in engem Kontakt mit anderen Organellen, um Überleben und Wachstum einer Zelle zu gewährleisten. Zusätzlich bildet das ER Kontakte mit der Plasmamembran (PM) aus. An diesen Kontakten finden Lipidtransfer und Kopplung von Ca2+-Signalen statt. Eine Komponente des kortikalen ERs in der Bäcker-Hefe ist das integrale Membranprotein Ist2. Die Sortierung von Ist2 in das kortikale ER erfolgt mit Hilfe seines kortikalen Sortierungssignals (CSS), das an Lipide der PM bindet. Da bisher nicht bekannt war, ob Ist2 im kortikalen ER verbleibt oder durch einen unkonventionellen Weg zur Plasmamembran gelangt, habe ich die Lokalisation von Ist2 in mammalischen Zellen untersucht. Meine Ergebnisse demonstrieren, dass Ist2 das ER nicht verläßt und dort periphere Domänen ausbildet, die in enger Nachbarschaft zur PM liegen. Um die Merkmale dieser peripheren ER-Strukturen weiter zu analysieren, habe ich mammalische Typ1-Membranproteine mit dem CSSIst2 markiert und deren Lokalisation untersucht. Durch die Interaktion des CSSIst2 mit Lipiden der PM wurden alle getesteten Chimären zu den peripheren ER-Strukturen rekrutiert. Weiterhin konnte ich zeigen, daß diese peripheren ER-Strukturen statisch und mit dem restlichen ER verbunden sind. Neben dem Hefeprotein Ist2 sind die mammalischen Proteine STIM1 und STIM2 ebenfalls in der Lage, ER-PM-Kontaktstellen zu bilden. STIM-Proteine haben ihre Funktion in der Signalverstärkung während des Speicher-abhängigen Ca2+-Eintritts. Sie erkennen Ca2+-Konzentrationen durch ihre N-terminalen EF-Hand-Domänen. Nach Ca2+-Depletion des ERs multimerisieren sie und formen ER-PM-Kontaktstellen, an denen sie mit dem Ca2+-Kanal der PM, Orai1, interagieren und diesen aktivieren. Darüber hinaus habe ich den molekularen Mechanismus der Ausbildung von ER-PM-Kontaktstellen aufgedeckt. Durch in vitro Liposomen-Bindungsstudien habe ich gezeigt, dass die C-Termini von STIM1 und STIM2 mittels ihrer Lysin (K)-reichen Domänen an Lipide der PM binden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, daß die Ausbildung der ER-PM-Kontaktstellen von der Expression einen integralen membranenprotein mit einem PM-Lipid-Bindungssignal abhängig ist. Da für das STIM1-Protein bereits eine Lokalisation an der Zelloberfläche demonstriert worden war, habe ich seine Retention im ER untersucht. Dabei konnte ich zwei Mechanismen identifizieren. Der erste Mechanismus beruht auf dem Zurückhalten des STIM1-Proteins im ER über mehrere Di-Arginin ER-Retentionssignale. Der zweite Mechanismus ist abhängig von der cytosolischen Ca2+-Konzentrationen. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Depletion von cytosolischem Ca2+ den Transport von STIM1 an die Zelloberfläche fördert, wo STIM1 Orai1 aktiviert. Ausgehend von meinen Daten erkennt STIM1 indirekt das cytosolische Ca2+ durch seine K-reiche Domäne, die Ca2+ im Komplex mit Calmodulin bindet. Somit integriert STIM1 Ca2+-Signale im ER und im Cytosol.

Translation of abstract (English)

The endoplasmic reticulum (ER) has a distinct morphology, which is formed of sheets and tubules. These different domains are devoted to diverse functions such as co-translational protein translocation, lipid synthesis, protein folding, quality control and transport of proteins and lipids to different organelles. Close contacts of the ER with other organelles promote survival and growth of cells. The contacts with the plasma membrane (PM) are essential for lipid transport and Ca2+ signalling. A component of the cortical ER in yeast is the polytopic membrane protein Ist2. Sorting of Ist2 into the cortical ER depends on its cortical sorting signal (CSS), which directly binds PM-lipids. Since it was unknown whether Ist2 remains in the cortical ER or travels to the PM by an unconventional pathway, I investigated the localization of Ist2 in mammalian cells. I found that Ist2 resides in the ER, where it forms peripheral domains that are in close proximity of the PM. In order to further investigate the features of the peripheral ER structures, I tagged mammalian type 1 membrane proteins with the CSSIst2 and analyzed their localization. As a consequence of the interaction of CSSIst2 with the PM-lipids, all tested chimeras were recruited to peripheral ER structures. Moreover, I demonstrated that these peripheral ER domains are static and in continuity with the rest of the ER. Besides yeast Ist2, mammalian STIM1 and STIM2 proteins, are capable of forming ER-PM contact sites. STIM proteins function in signal amplification during store-operated Ca2+ entry. They sense the ER Ca2+ levels by their N-terminal EF-hand domains and upon depletion of ER Ca2+, they multimerize and form ER-PM contact sites. At these sites they interact with and activate the PM Ca2+ channel, Orai1. I investigated the molecular mechanism behind this ER-PM contact site formation. By in vitro liposome binding experiments, I showed that both STIM1 and STIM2 cytosolic C-termini bind to PM-lipids via their lysine (K)-rich domains. Taken together, I found that the formation of ER-PM contact sites is dependent on expression of a transmembrane protein with a PM-lipid binding signal. Finally, since STIM1 was previously shown to localize to the cell surface, I focused on its ER-retention mechanisms. I identified two types of mechanisms. In the first mechanism, the ER-retention is achieved by multiple di-arginine signals. The second mechanism is dependent on cytosolic Ca2+ levels. I found that depletion of cytosolic Ca2+ promoted trafficking of STIM1 to the cell surface, where it may activate Orai1. I propose that STIM1 indirectly senses the cytosolic Ca2+ via its K-rich domain, which binds to Ca2+/calmodulin. Thus, STIM1 integrates the Ca2+ signals in the ER and the cytosol.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Seedorf, Dr. PD Matthias
Date of thesis defense: 30 June 2011
Date Deposited: 04 Jul 2011 10:29
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: ER-PM contact sites
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