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Chromatin regulation by the histone acetyltransferase MOF in Drosphila

Conrad, Thomas

German Title: Chromatin Regulation durch die Histonacetyltransferase MOF in Drosophila

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Abstract

Like in mammals, sex determination in Drosophila melanogaster involves an unequal distribution of sex chromosomes, with male flies carrying an X and a Y chromosome, as compared to two Xs in females. To prevent the deleterious effects of chromosomal aneuploidy, flies have evolved a dosage compensation system, which upregulates transcription from the single male X chromosome to match transcript levels produced from the two female Xs. This transcriptional activation is achieved by the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein complex consisting of five male specific lethal proteins (MSL) and two non coding RNAs on the X (roX). The DCC is physically tethered to hundreds of target loci along the male X chromosome, where it promotes hyper acetylation of X-linked chromatin at Lysine 16 of histone H4 (H4K16ac). This histone mark is associated with an open, permissive chromatin structure, and its enrichment on the male X chromosome is thought to be required for the twofold increase in X-linked transcription during dosage compensation. However, the exact mechanism by which X-linked transcription is activated in males is still unknown. Responsible for hyper-acetylation of the male X chromosome is the histone acetyltransferase males absent on the first (MOF), which is part of the DCC. Recent studies have shown that MOF plays an additional role in autosomal gene regulation, as it has been found at thousands of autosomal gene promoters as part of the non specific lethal (NSL) complex. However, to what extent H4K16ac at autosomal genes is MOF-dependent, and how MOF is differentially distributed between the two complexes is currently unknown. During the course of my PhD, I used genetic, biochemical, and genomewide approaches to address a wide range of questions, concerning MOF functions in autosomal gene regulation and dosage compensation; the DCC recruitment process to X-linked target genes; and the mechanism of transcriptional upregulation of X-linked genes during dosage compensation. Besides other contributions, investigating the role of the H3K36 specific methyltransferase HypB/Set2 during MSL targeting and dosage compensation, as well as the role of MOF for NSL function at autosomal promoters, I was addressing these questions in the context of two main projects. During the first one of these, I have been able to show that MOF is responsible for genomewide H4K16ac in male and female flies, and that MOF is an essential gene in females. I demonstrated that the Drosophila specific unstructured N-terminus of the MOF protein is required for assembly of the DCC on the male X chromosome, and at the same time constrains MOFs HAT activity. The N-terminus therefore controls MOFs function in X chromosome compensation. I was furthermore able to reveal the biological role of the chromobarrel domain, which is conserved from yeast to human. Unexpectedly, disruption of the MOF chromobarrel domain, which has been shown previously to be required for MOF interaction with roX RNAs, led to a dramatic loss of H4K16ac from all chromosomes. Accordingly, I showed that the chromobarrel domain serves to trigger H4K16ac after the recruitment of MOF to its chromatin targets, revealing for the first time a biological role of this domain in vivo. In a parallel project, to work towards unraveling of the dosage compensation mechanism, I wanted to identify the step in the RNA PolII transcription cycle at which dosage compensation operates in flies. To this end, I generated genomewide profiles of RNA PolII in 3rd instar larva salivary glands from male and female flies, and from male flies with disrupted dosage compensation. Strikingly, we find that the density of PolII is approximately twofold elevated on the male X chromosome as compared to autosomes, including X-linked promoters. This data suggests that dosage compensation operates via enhanced transcription initiation, which constitutes a major advance in our understanding of the dosage compensation process.

Translation of abstract (German)

Geschlechtsbestimmung in Drosophila geht, wie auch in Säugetieren, einher mit der ungleichen Verteilung von Geschlechtschromosomen. Männliche Fruchtfliegen tragen ein X und ein Y Chromosom, im Gegensatz zu zwei X Chromosomen in Weibchen. Um die negativen Konsequenzen chromosomaler Aneuploidie zu verhindern haben Fruchtfliegen im Verlauf der Evolution ein Dosiskompensationssystem entwickelt, welches die Transkription vom männlichen X Chromosom zweifach erhöht und somit das Transkriptionsniveau der zwei weiblichen X Chromosomen erreicht. Diese Aktivierung wird durch den „dosis compensation complex“ (DCC) bewirkt, ein Ribonucleoproteinkomplex bestehend aus fünf „male specific lethal“ (MSL) Proteinen und zwei nicht kodierenden „RNAs on the X“ (roX). Der DCC bindet an hunderte von Zielorten auf dem männlichen X Chromosom, wo er die Hyperazetylierung von X chromosomalem Chromatin an Lysin 16 von Histon H4 (H4K16ac) vermittelt. Diese Histonmodifikation ist mit einer offenen, permissiven Chromatinstruktur assoziiert, und es wird angenommen dass ihre Anreicherung auf dem männlichen X Chromosom für die zweifache Aktivierung der X chromosomalen Transkription wärend der Dosiskompensation notwendig ist. Ungeachtet dessen ist der exakte Mechanismus durch den X chromosomale Transkription in Männchen aktiviert wird unbekannt. Verantwortlich für die Hyperazetylierung des männlichen X Chromosoms ist die Histonazetyltransferase „males absent on the first“ (MOF), welche Teil des DCC ist. Es wurde kürzlich gezeigt dass MOF eine zusätzliche Funktion in autosomaler Genregulation hat, da es an tausenden von Genpromotoren als Teil des „non specific lethal“ (NSL) Komplex gefunden wurde. Zu welchem Grad H4K16ac an autosomalen Genen allerdings von MOF abhängig ist, und wie die Verteilung von MOF zwischen den beiden Komplexen reguliert wird ist nicht bekannt. Im Verlauf meiner Promotion habe ich genetische, biochemische und genomweite Verfahren verwendet um einen weiten Bereich von Fragen bezüglich der Funktion von MOF in autosomaler Genregulation und Dosiskompensation, der Bindung des DCC an X chromosomale Gene, und des Mechanismus der transkriptionellen Aktivierung X chromosomaler Gene wärend der Dosiskompensation zu beantworten. Neben Beiträgen zu anderen Arbeiten, darunter Untersuchungen zur Rolle der H3K36 spezifischen Methyltransferase HypB/Set2 in der Dosiskompensation, sowie zur Rolle von MOF für die Funktion von NSLs, habe ich diese Fragen im Kontext zweier Projekte adressiert. Im Verlauf dieser Arbeiten konnte ich zunächst zeigen dass MOF in männlichen und weiblichen Fliegen genomweit für H4K16ac verantworlich, und ein essentielles Gen in Zusammenfassung 8 Weibchen ist. Ich zeige dass der Drosophila spezifische unstrukturierte N-terminus von MOF für den Aufbau des DCC auf dem männlichen X Chromosom erforderlich ist und gleichzeitig die enzymatische Aktivität von MOF hemmt. Der N-terminus kontrolliert daher MOFs Funktion für die Kompensation des X Chromosoms. Weiterhin habe ich die biologische Funktion der von Hefe bis Mensch konservierten Chromobarrel Domäne im MOF protein aufgezeigt. Überraschenderweise führt die Mutation der Chromobarrel Domäne, welche für die Interaktion von MOF mit roX RNA nötig ist, zu einer dramatischen Abnahme von H4K16ac auf allen Chromosomen. Ich konnte somit zum ersten Mal eine biologische Funktion der MOF Chromobarrel Domäne in vivo zeigen, welche darin besteht H4K16ac nach der Rekrutierung von MOF zum Chromatin auszulösen. In einem parallelen Projekt, welches darauf abzielt den Mechanismus der Dosiskompensation zu erhellen, wollte ich bestimmen an welchem Schritt des RNA Polymerase II Transkriptionszyklus Dosiskompensation in Fliegen agiert. Hiefür habe ich genomweite Bindungsprofile von RNA Polymerase II in Speicheldrüsen von männlichen und weiblichen Larven, und von Larven mit beeinträchtigter Dosiskompensation hergestellt. Diese Analyse zeigt dass RNA Polymerase II auf dem männlichen X Chromosom ungefähr zweifach angereichert ist, einschliesslich an Genpromotoren. Dieses Ergebnis legt nahe dass Dosiskompensation auf der Ebene der Transkriptionsinitiation arbeitet, was einen bedeutenden Fortschritt für unser Verständniss der Dosiskompensation darstellt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spitz, Dr. Francois
Date of thesis defense: 28. June 2011
Date Deposited: 26. Jul 2011 10:30
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Epigenetik, Drosophila, Taufliege, Histon-Acetyltransferase, Dosiskompensation, Transkription, Transkription <Genetik>
Uncontrolled Keywords: Drosophila , histone acetlytransferse , transcription regulation , epigenetics , MSL
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