Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

A biochemical study of roX2 interacting proteins

Ilik, Ibrahim Avsar

German Title: Biochemische Untersuchung von roX2 interagierenden Proteinen

[img]
Preview
PDF, English
Download (32Mb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Dosage compensation is a biological phenomenon where a sexually dimorphic organism balances the inequality in gene expression that results from unequal distribution of sex chromosomes. Different organisms have invented different ways to carry out dosage compensation. For instance, in mammals females transcriptionally down-regulate one of the two X-chromosomes they possess to match the male gene expression. Flies, on the other hand, hyper-transcribe the single male X-chromosome to reach the transcriptional output generated by two X-chromosomes in females. A ribonucleoprotein complex, called the Male Specific Lethal (MSL) complex is essential for fly dosage compensation. It is composed of five proteins and two non-coding RNAs called the roX RNAs. The complex contains at least two enzymes: MOF, an acetyltransferase that specifically acetylates Histone 4 Lysine 16; and MLE, a DNA/RNA helicase. Both enzymatic activities are indispensible for dosage compensation. Evidence coming from genetic studies have shown that male flies lacking both roX RNAs die due to a failure in dosage compensation, although these ncRNAs are redundant in function and only one of the two is enough to rescue male lethality. MLE was shown to be required for the incorporation of these RNAs into the MSL complex although it is not clear if this is the only function of MLE in dosage compensation During the first part of my PhD I carried out a tandem affinity purification to reveal proteins that interact with MLE in an effort to understand its role in dosage compensation. In accord with previous observations, I have not been able to detect any protein that stably interacts with MLE under various purification conditions. This work thus supports the view that MLE is a lone RNA-helicase and is recruited to the X chromosome by its interaction with the roX RNAs. In the second part of my thesis I describe the biochemical purification and analysis of roX2 interacting proteins in vitro. With this approach I have identified MLE and two novel proteins; CG5787 and CG3613 that interact with roX2 RNA specifically. Interestingly, CG5787 and CG3613 were found to co-localize with each other and with MLE on chromatin. CG3613 was also shown to interact with roX2 RNA in vivo validating the initial in vitro approach. By using ChIP analysis I was able to detect CG3613 on high-affinity sites on the X-chromosome, which might indicate that it is recruited to the X-chromosome via roX RNA similar to MLE. CG3613 was further characterized and found to be a phosphoprotein in vivo. CG3613 also co-localizes with RNA polymerase II and is recruited to heat-shock loci after a brief heat-shock, indicating a strong relationship with transcription. Knocking-down CG3613 in flies was lethal, but in S2 cells reduction of its levels lead to the stabilization of intron-containing pre-mRNA suggesting a role in pre-mRNA processing. This work was the first attempt to biochemically define roX2 interacting proteins in flies and shows that the MSL proteins are not the only proteins that roX RNAs interact with. In fact, this study suggests that roX RNAs’ role may be to act as a platform that brings together various proteins in addition to the MSL complex to hyper-transcribe the male X chromosome.

Translation of abstract (German)

Die Dosis-Kompensation ist ein biologisches Phänomen, in welchem ein geschlechtlich dimorpher Organismus das Ungleichgewicht in der Genexpression, das aus der ungleichmäßigen Verteilung der Sex-Chromosomen resultiert, ausgleicht. Verschiedene Organismen haben verschiedene Wege entwickelt, wie die Dosis-Kompensation erreicht wird. Bei Säugetieren z.B. unterdrückt das Weibchen transkriptional eines der beiden X-Chromosomen, die sie besitzt, um mit der männlichen Genexpression gleichzuziehen. Auf der anderen Seite benutzt die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster die Hypertranskription des einzigen männlichen X-Chromosoms, um die transkriptionelle Leistung , die durch die zwei X-Chromosome bei Weibchen generiert wird, zu erreichen. Ein Ribonucleoprotein-Komplex, den man MSL (Male Specific Lethal) Komplex nennt, ist in der Dosis-Kompensation von Fruchtfliegen dabei unverzichtbar. Er besteht aus fünf Poteinen und zwei nicht kodierenden RNA’s, den sogenannten roX RNA’s. Dieser Komplex beinhaltet mindestens zwei Enzyme: MOF, eine Azetyltransferase, die spezifisch das Histone 4 an der Position Lysine 16 azetyliert, und MLE, eine DNA/RNA -Helicase. Beide enzymatische Aktivitäten sind essentiell für die Dosis-Kompensation. Genetische Studien belegen, dass männliche Fruchtfliegen, denen beide roX RNA’s fehlen, an einem Fehler in der Dosis-Kompensation sterben, obwohl diese ncRNA’s in der Funktion überflüssig sind und nur eine der Beiden ausreicht, um die männliche Lethalität zu retten. Es wurde gezeigt, dass MLE für die Inkorporation dieser RNA’s in den MSL Komplex notwendig ist, obwohl nicht klar ist, ob dies die einzige Funktion von MLE in der Dosis-Kompensation ist. Um die Rolle von MLE in der Dosis-Kompensation zu verstehen, führte ich während des ersten Teils meiner Doktorarbeit eine Tandem-Affinitäts-Reinigung durch, um jene Proteine erkennbar zu machen, die mit MLE zusammenwirken. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen konnte ich kein neues Protein entdecken, das stabil mit MLE unter verschiedenen Aufreinigungsbedingungen zusammenwirkt. Diese Arbeit untermauert deshalb die Ansicht, dass MLE eine einzelne RNA-Helicase ist und durch das Zusammenwirken mit den roX RNA’s zu den X-Chromosomen rekrutiert wird. Im zweiten Teil meiner Thesis beschreibe ich die biochemische Aufreinigung und Analyse von mit roX2 zusammenwirkenden Proteinen in vitro. Mit diesem Ansatz habe ich MLE und zwei neuartige Proteine identifiziert; CG5787 und CG3613, die mit roX2 -RNA spezifisch zusammenwirken. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass CG5787 und CG3613 miteinander und mit MLE auf Chromatin kolokalisieren. CG3613 bindet roX2 RNA auch in vivo, was den vorherigen in vitro Ansatz bestätigte. Durch eine ChIP Analyse war es mir möglich, CG3613 auf hochaffinen Stellen auf dem X-Chromosom zu detektieren; dies könnte ein Hinweis dafür sein, dass die Rekrutierung zum X-Chromosom, ähnlich wie bei MLE, mit Hilfe der roX RNA gewährleistet wird. CG3613 wurde weiter charakterisiert und dabei festgestellt, dass es sich in vivo um ein Phosphoprotein handelt. CG3613 tritt auch gemeinsam mit der RNA Polymerase II auf und wird nach einem kurzen Hitzeschock zu Hitzschockloci rekrutiert, was ein Hinweis auf eine starke Verbindung zur Transkription ist. Ein Knock-down von CG3613 in Fruchtfliegen war lethal, jedoch führte ihre Reduktion in S2 Zellen zu einer Stabilisierung von intronhaltigen pre-mRNA’s. Dies gibt zu der Vermutung Anlass, dass es eine Rolle in der pre-mRNA Verarbeitung spielt. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die mit roX2 interagierenden Proteine in der Fruchtfliege biochemisch definiert und dabei gezeigt, dass die MSL Proteine nicht die einzigen Proteine sind, mit denen roX RNAs zusammenwirken. Tatsächlich lässt diese Untersuchung darauf schließen, dass roX RNA’s als Plattform dienen, um diese verschiedenen Proteine zusätzlich zu dem MSL-Komplex, zusammenzubringen und damit die Hypertranskription des männlichen X-Chromosoms zu gewäherleisten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hentze, Prof. Dr. Matthias W.
Date of thesis defense: 22 June 2011
Date Deposited: 26 Jul 2011 10:20
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Helicasen, RNS-Bindungsproteine, Non-coding RNA
Uncontrolled Keywords: Dosage compensation
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative