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Mitochondrial Morphology Dynamics during Apoptosis - An integrative modeling approach

Melo Mendes dos Reis, Yara

German Title: Ein integrierter Ansatz zur Modellierung mitochondrialer Morphologie während der Apoptosis

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Abstract

Mitochondria are central to many important cellular functions. The entire mitochondrial population is in constant flux, driven by continuous fusion and division of mitochondria. Defects in mitochondrial dynamics can cause deficits in mitochondrial respiration, morphology and motility leading to apoptosis under extreme conditions. An important and still unresolved question is how the heterogeneity of mitochondrial morphology, distribution and function are mechanistically realized in the cell. Importantly, to what extent is mitochondrial morphology dependent or affects cell fate decisions. Despite the intense focus on unraveling connections between mitochondrial morphology and severe human pathologies, the analysis and systematic description of mitochondrial phenotypes remains an open challenge. Current approaches to study mitochondrial morphology are limited by low data sampling coupled to manual identification and simplistic classification of complex morphological phenotypes. The overall goal of this work was to elucidate the nature of the relationship between mitochondria morphology and apoptotic events. Diverse apoptotic triggers were systematically tested and data concerning mitochondrial phenotypes and injury was collected to infer cause and consequence relationships. Therefore, high-resolution fluorescence imaging was employed to extract high-content information essential to identify and quantify spatial and conformational events in the single cell. These included monitoring of mitochondrial membrane permeability and quantification of Bax activation under matched conditions to assess mitochondrial stress. Experimentally, mitochondrial morphological transitions were followed in human breast carcinoma MCF-7 cells by tagging a mitochondrial inner membrane protein with a fluorescent probe. We made use of apoptotic conditions that have been previously reported to cause mitochondrial fragmentation or swelling. Wide field microscopy allowed for the collection of images containing cells with mostly networked, fragmented or swollen mitochondria. Next, image analysis was performed to extract several mitochondrial features that better characterize each class. These were grouped and used to build a decision tree-based classifier that automatically classifies individual mitochondria into the correspondent phenotypic class. Our population-based classifier accounts for intracellular sub-classes, intermediate mitochondrial stages and reproduces intercellular variances with high accuracy. Our results show that distinct apoptotic stimuli lead to subtle but significant differences in mitochondrial morphology within cell population that can be specific to a particular insult. Interestingly, there was no direct relation between the induced-mitochondrial classes and the analyzed apoptotic steps. In fact, some apoptotic drugs, which are known to cause similar mitochondrial damage, showed distinct mitochondrial morphology. Therefore, the observed heterogeneous response of mitochondria to stress strongly suggests that more complex, non-linear interactions exist. Here, we propose an integrated mechanistic and data-driven modeling approach to analyze heterogeneously quantified datasets and infer hierarchical interactions between mitochondrial morphology and apoptotic events. Our modeling results suggest that Bax activation leads to mitochondrial fragmentation, which is strongly associated with mitochondrial membrane depolarization events. In turn, the loss of mitochondrial membrane potential is closely related to mitochondrial swelling. Our model predictions are in accordance with previous published results and thereby validate our modeling approach that can now be easily extended to include new datasets. Surprisingly, mitochondrial fragmentation was not the most prominent phenotype, even under conditions where Bax activation was considerably high. Instead, swollen-mitochondria seem to be closer related to mitochondrial-associated death pathways. Next steps include the extension of our pipeline in a time-resolved manner and combined datasets acquisition in order to further investigate this hypothesis. In summary, we have established and validated a platform for mitochondrial morphological and functional analysis that offers results in an unbiased, systematic and statistically relevant manner. We believe the developed platform is suitable to be extensively used in the investigation of specific molecular targets. Possible applications include RNAi screens (e.g. morphology proteins) or extended compound libraries in a high-throughput mode. Importantly, it can now be further adjusted to other studies relevant to mitochondrial programmed cell death that will hopefully lead into the better understanding of mitochondrial role in physiology and disease progression.

Translation of abstract (German)

Mitochondrien sind für viele wichtige Zellfunktionen wesentlich. Durch ständige Verschmelzungen und Teilungen der Mitochondrien unterliegt die Gesamtpopulation der Mitochondrien einer andauernden Veränderung. Eine eingeschränkte Dynamik der Mitochondrien kann zu Defiziten bei der Zellatmung, der Morphologie und der Beweglichkeit führen, welche unter Umständen wiederum den Zelltod zur Folge haben können. Eine wichtige und bisher unbeantwortete Frage ist, wie die Vielfalt und Verschiedenartigkeit der mitochondrialen Morphologie mechanisch in den Zellen verwirklicht wird. Besonders relevant ist die Frage, in welchem Ausmaß die mitochondriale Morphologie abhängig oder sogar ausschlaggebend für das Schicksal der Zelle ist. Neben der Beantwortung der Frage, welche Beziehungen zwischen der Morphologie der Mitochondrien und menschlichen Pathologien bestehen, ist die systematische Erfassung und Analyse der notwendigen Daten eine Herausforderung. Ein Problem aktueller Methoden ist die ungenügende Menge an Daten und somit deren lediglich qualitative Analyse. Auf der anderen Seite ist eine manuelle Klassifizierung und Auswertung komplexer Daten aufwendig und möglicherweise nicht objektiv genug, um aussagekräftige, quantitative Daten zu erhalten. Das Hauptziel dieser Arbeit ist, die Beziehungen von der mitochondrialen Morphologie zu Apoptose aufzuzeigen. Dazu wurden einerseits Veränderungen in der Morphologie, andereseits Veränderungen der Integrität der Mitochondrien unter verschiedenen Apoptose-auslösenden Substanzen systematisch untersucht. Mit Hilfe von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie konnten quantitative Daten über die räumlichen Lage und Konformation der Mitochondrien in einzelnen Zellen erhalten werden. Um die Integrität der Mitochondrien unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen, wurde deren Permeabilität sowie Aktivierung von Bax gemessen. Für die Studie wurde die Mammakarzinom-Zellinie MCF-7 verwendet und deren Mitochondrien mit Hilfe eines fluoreszenz-markierten Proteins visualisiert, das in der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiert ist. Um die Zellen zu stimulieren, wurden Substanzen verwendet, von denen berichtet ist, dass sie mitochondriale Zertrümmerungen oder Schwellungen verursachen. Mit Hilfe der Weitfeld-Mikroskopie wurden Zellen aufgenommen, die vernetzte, zertrümmerte oder geschwollenen Mitochondrien aufwiesen. Dann wurden mit Hilfe von Bildverarbeitung Strukturen ermittelt, die eine klare Klassifizierung der verschiedenen Phänotypen ermöglichen. Aus diesen Gruppierungen wurde ein Stammbaum gebildet, der als Sortierwerkzeug automatisch jedes individuelle Mitochondrium dem entsprechenden, korrespondierenden Phänotyp zuweist. Diese Möglichkeit der Sortierung auf der Grundlage der ganzen Mitochondrien-Population bezieht sich ebenfalls auf interzelluläre Untergruppen sowie mitochondriale Zwischenstadien und reproduziert interzellulare Varianten mit exakter Präzision. Die Ergebnisse zeigen, dass die Morphologie der Mitochondrien in MCF-7 Zellen einen feinen, aber signifikanten Unterschied aufweisen, wenn sie deutlichen apoptischen Stimulationen ausgesetzt sind, und zwar innerhalb einer Zellpopulation, die für bestimmte Substanzen spezifisch sind. Interessanter Weise gibt es keinen direkten Zusammenhang zwischen den induzierten mitochondrialen Klassen und dem Ablauf der Apoptose. Tatsächlich zeigen manche apoptotische Substanzen, die dafür bekannt sind, ähnliche mitochondriale Schäden hervorzurufen, deutlich unterschiedliche Morphologien. Die beobachtete, heterogene Reaktion der Mitochondrien gegenüber Stress lassen auf komplexe nicht-lineare Interaktionen schließen. Der von uns vorgeschlagene datenorientierte Modellierungsansatz analysiert heterogene Datensätze und leitet daraus hierarchische Interaktionen zwischen der mitochondrialen Morphologie und Apoptose ab. Die Ergebnisse der Modellierung lassen vermuten, dass Bax Aktivität zur Fragmentierung und Depolarisierung von Mitochondrien führt. Der Verlust des mitochondrialen Membran-Potentials ist wiederum eng mit dem Anschwellen der Mitochondrien verknüpft. Die Aussagen unseres Modells stimmen mit den Ergebnissen von anderen, neuen Publikationen überein und bestätigen den Modellierungsansatz, welcher leicht erweitert werden kann, um neue Datensätze auszuwerten. Überraschenderweise war Fragmentierung von Mitochondrien nicht der bedeutendste Phänotyp, selbst unter Umständen, in denen die Bax Aktivität ausgesprochen hoch waren. Die Ergebnisse zeigen stattdessen einen engen Zusammenhang geschwollener Mitochondrien zum Mitochondrienabhängigen Zelltod. Weitere Schritte schließen die Aufnahme zeitlich nah aufgelöste Bilder lebender Zellen und deren Strukturen ein und den damit verbundenen Ausbau des Arbeitsablaufs, sowie die Integrierung neuer Datensätze, um die Hypothesen weiter zu untersuchen. Es wurde eine Methode für die objektive Analyse der mitochondrialen Morphologie entwickelt und getestet, die statistisch aussagekräftige Ergebnisse aus systematisch durchgeführten Experimenten geliefert hat. Wir glauben, dass diese entwickelte Plattform sehr gut dazu geeignet ist, um bei der Erforschung spezifischer sogenannter molekularer targets eingesetzt zu werden. Dabei könnten RNAiscreens oder sogenannte chemical libraries hier Anwendung finden, da unsere Methode die Analyse der Daten im Hochdurchsatzverfahren erlaubt. Somit könnten Studien adaptiert werden, die zum Verständnis der Funktion von Mitochondrien in Krankheitsverläufen beitragen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 27. July 2011
Date Deposited: 19. Aug 2011 14:21
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Apoptosis , Mitochondria , Phenotype classification , Modeling
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