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Funktionelle Charakterisierung pflanzlicher Endosomen

Scheuring, David

English Title: Functional characterization of plant endosomes

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PDF, German
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Abstract

Synthese und Abbau von Proteinen müssen in einem dynamischen Gleichgewicht stehen, damit die Zelle sowohl ihre grundlegenden Funktionen wahrnehmen als auch auf externe Stimuli reagieren kann. Während der Abbau von löslichen Proteinen Ubiquitin-abhängig über das Proteasom im Cytosol vermittelt wird, erfordert der Abbau von Membranproteinen Wechselwirkungen mehrerer Proteinkomplexe, zusammenfassend als ESCRT-Maschinerie (endosomal sorting complex required for transport) bezeichnet und beinhaltet mehrere Transportprozesse an endosomalen Membranen. Dabei übernimmt die ESCRT-Maschinerie die Sortierung von Membranproteinen in die intraluminalen Vesikel (ILV) der multivesikulären, späten Endosomen (multivesicular body, MVB) und ermöglichen so den Transport in das vakuoläre Lumen und damit letztlich den Abbau zu degradierender Proteine. In Hefe und Säugern konnte gezeigt werden, dass ubiquitinierte Proteine der Plasmamembran internalisiert und von der ESCRT-Maschinerie erkannt werden. In Pflanzen wurden bislang nur wenige Komponenten dieser Maschinerie funktionell charakterisiert und bisher konnte weder eine Ubiquitin-vermittelte Internalisierung von Membranproteinen noch eine Interaktion dieser Proteine mit ESCRT-Komponenten an endosomalen Kompartimenten gezeigt werden. Für die Charakterisierung der ESCRT-Maschinerie und zur Untersuchung ihrer Rolle an der Biogenese verschiedener Kompartimente, wurden biochemische, genetische und ultrastrukturelle Methoden kombiniert. Durch die Produktion von Antikörpern gegen ESCRT-Komponenten und durch die Expression bestimmter ESCRT-Proteine, wurden Lokalisierungsstudien durchgeführt und eine graduelle Verteilung der ESCRT-Maschinerie entlang der Kompartimente des vakuolären Transportwegs gefunden. Die funktionelle Analyse von ESCRT-Mutanten zeigte, dass der vakuoläre Transport von diesen Komplexen abhängt und der Transport vom frühen Endosom (TGN/EE) zum späten Endosom (MVB/LE) nicht durch Transportvesikel sondern durch einen Reifungsprozess erfolgt. Die Reifung des MVB/LE aus Membranen des TGN/EE wurde durch den Nachweis von TGN-MVB Hybrid-Strukturen bestätigt. Des Weiteren konnte Ubiquitin als Sortierungssignal für endocytischen Transport in Pflanzen identifiziert und Erkenntnisse über die Bedeutung des Ubiquitinierungs-Status von zu degradierenden Proteinen gewonnen werden. Untersuchungen am Gesamtorganismus (Arabidopsis t-DNA-Insertionslinien) zeigten, dass die Funktionalität der ESCRT-Maschinerie nicht nur auf molekularbiologischer Ebene, sondern auch für die Entwicklung der Pflanze von großer Bedeutung ist.

Translation of abstract (English)

In order to maintain homeostasis and to react to external stimuli, synthesis and degradation of proteins have to be dynamically balanced. While degradation of soluble proteins is dependent on the proteasome, far less is known about the turnover of membrane proteins. For degrading a membrane protein several large protein complexes – the ESCRTs (endosomal sorting complex required for transport) have to work hand in hand to mediate transport events at endosomal membranes. Especially the sorting of membrane proteins into so called intraluminal vesicles (ILVs) of multivesicular late endosomes (MVB/LE) is crucial for the subsequent degradation in the lumen of the vacuole. In yeast it has been shown that the ESCRT-machinery binds and internalizes ubiquitinated proteins of the plasma membrane. In plants only a few components of this machinery have been functionally characterized. Neither an ubiquitin-dependent internalization of membrane proteins, nor the interaction of these proteins with the ESCRT-machinery at endosomal membranes has been described so far. For the characterization of the ESCRT-machinery and to investigate its role in the biogenesis of endosomal compartments, biochemical, molecular and genetic methods have been combined. The production of antibodies and expression of selected ESCRT-subunits led the way for localization studies which revealed a gradual distribution of the ESCRT-machinery along compartments of the vacuolar transport route. Functional analysis of ESCRT-mutants showed that vacuolar transport and in particular transport steps from early endosomes (TGN/EE) to late endosomes (MVB/LE) require the functionality of ESCRT. This and the existence of TGN-MVB hybrid-structures suggest, that transport between early and late endosomes occurs via maturation rather than via vesicular transport. Electron microscopical evidence confirmed that MVBs/LEs mature from the TGN/EE. Furthermore, ubiquitin could be identified as a sorting signal for internalization and endocytic uptake of membrane proteins in plants. The importance of the two C-terminal glycines of ubiquitin for internalization was examined. Finally, the functionality of the ESCRT-machinery for developmental processes at the level of the entire plant was investigated.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Robinson, Prof. Dr. David G.
Date of thesis defense: 26. July 2011
Date Deposited: 31. Aug 2011 09:46
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteintransport, Vakuole, Rezeptor, Endocytose, Ubiquitin
Uncontrolled Keywords: ESCRT , Membranproteine , MVB , Ubiquitin , vakuolärer TransportESCRT , membrane proteins , multivesicular body , ubiquitin , vacuolar transport
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