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Molekulare Struktur- und Funktionsanalyse der Transkriptionskontrolle der GeneDDX3X und DDX3Y in der männlichen Keimbahn

Rauschendorf, Marc-Alexander

English Title: Molecular structure and function analysis of the transcription control of the DDX3X and DDX3Y genes in the male germ line

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Abstract

Das Y-chromosomale Gen DDX3Y und das X-homologe Gen DDX3X kodieren zwei RNA-Helikasen der DEAD-Box Familie, die beide funktionell in verschiedenen Phasen der Human Spermatogenese aktiv sind (Ditton et al., 2004). Deletionen der „Azoospermia Factor a“ (AZFa) Region in Yq11, in der DDX3Y lokalisiert ist, führen zu einem Totalverlust der männlichen Keimzellen, dem „Sertoli Cell-only“ (SCO)-Syndrom. Beide Gene weisen in den kodierenden Sequenzen eine hohe Konserviertheit (92,4%) ihrer Aminosäure-Sequenzen auf, was auf eine funktionelle Selektion beider Genkopien hindeutet. Die Promoter- und 5´UTR-Sequenzen haben dagegen, seit Fehlen der Rekombination der Säuger Gonosomen, deutliche Chromosomen-spezifische Sequenzveränderungen durchlaufen. Diese Veränderungen haben zur Entstehung einer komplexen hodenspezifischen Transkriptions- und Translationskontrolle beider Gene geführt. Auf Grund der Allel-spezifischen Sequenzevolution sind unterschiedliche Core-Promotermodule zur Keimbahn-spezifischen Expressionskontrolle etabliert worden. Einige Sequenzmotive geben auch erste Hinweise auf unterschiedliche Chromatinstrukturen der beiden Promoterdomänen. Durch die Kombination von vergleichender Genomik in sechs Säugerspezies (Mensch, Schimpanse, Rhesusaffe, Weißbüschelaffe, Rind, Maus) für beide Gene und gezielten Experimenten, konnten sowohl Allel-spezifische, als auch Spezies-spezifische cis-regulative Module identifiziert werden. So konnten in den Human DDX3(X/Y) Promoterregionen neun konservierte Sequenzblöcke kartiert werden. Ein solcher Sequenzblock ist der Y-spezifische MSY2 Minisatellit (Bao et al., 2000). Eine MSY2, bzw. homologe MSY2-X Basissequenz konnte in allen Spezies für DDX3Y und DDX3X stromaufwärts zu den Transkriptionseinheiten identifiziert werden. Eine Vervielfältigung der MSY2 Sequenz erfolgte allerdings nur in Primaten und nur in der Keimzell-spezifischen Promoterdomäne von DDX3Y. In den neun Human X-Y Sequenzblöcken wurden 24 X-Y konservierte Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBS) identifiziert. Besonders auffällig ist eine in allen untersuchten Spezies X-Y konservierte SOX5-TFBS, die in den MSY2 und MSY2-X Sequenzen lokalisiert ist. Insgesamt konnten 30 X-Y konservierte TFBS in den Human Promotersequenzen kartiert werden. Die Mehrzahl der dazugehörigen TFs weist eine Expression in Hodengewebe auf. Sechs gemeinsame TF-Module konnten identifiziert werden, wovon eines positionshomolog lokalisiert ist. Die konservierten TFBS und gemeinsamen TF-Module deuten somit auf einen gewissen Grad von Co-Regulation der beiden Gene in der männlichen Keimbahn hin. Daneben konnten zusätzlich mehrere Allel-spezifisch repetitive TFBS und TFBS-Cluster kartiert werden, die offensichtlich eine genspezifische Transkriptionskontrolle vermitteln. Die Kombination aus in-silico Analysen und gezielten Luziferase-Reportergenanalysen demonstriert somit eine erfolgreiche Strategie zur Identifizierung wesentlicher cis-Kontrollelemente für die DDX3(X/Y) Keimbahnexpression. Diese cis-Module sind daher gute Sequenzmotive für die molekulargenetische Mutationsanalyse bei infertilen Männern mit Verdacht auf Fehlfunktion der DDX3(X/Y) Expression.

Translation of abstract (English)

The Y-chromosomal gene DDX3Y and its X-chromosomal homolog DDX3X encode two RNA-Helicases of the DEAD-Box family. They are functional in different phases of the Human spermatogenesis (Ditton et al., 2004). Deletion of the Azoospermia Factor a (AZFa) interval in Yq11 in which DDX3Y is located, cause a complete loss of male germ cells. This pathology is called Sertoli Cell-only (SCO) syndrome. Both genes show in the coding sequences high conservation (92,4%) of their amino acid sequences, providing strong indication that both copies are under functional selective constraints. In contrast, the promoter and 5´UTR sequences have undergone dramatic chromosome-specific changes, probably evolved after the lack of recombination during evolution of mammalian sex chromosomes. This caused the development of a complex testis-specific transcriptional and translational control of both genes. Different core-promoter modules controlling their germ line expression arose due to the allele-specific sequence evolution. Some of the mapped sequence motives give also a lead to a probably different chromatin structure of both promoter domains. By combination of comparative genomics of both genes in six mammalian species (human, chimpanzee, macaque, marmoset, cattle, mouse) and selective experiments, allele-specific as well as species-specific cis-regulative modules could be identified. By this 9 conserved sequence blocks were mapped in the human DDX3(X/Y) promoter regions. One of these blocks is the Y-specific minisatellite MSY2 (Bao et al., 2000). A basic MSY2 and MSY2-X sequence respectively could be identified upstream of the DDX3Y and DDX3X transcription units in all analysed species. An amplification of the MSY2 minisatellite sequence occurred only in primates and only in the germ cell specific promoter domain of DDX3Y gene. 24 X-Y conserved transcription factor binding sites (TFBS) could be identified in the 9 X-Y conserved sequence blocks. Most striking is one X-Y conserved SOX5-TFBS which could be localised in all species in the MSY2 and MSY2-X sequences respectively. In total 30 different X-Y conserved TFBS could be mapped in both human promoter sequences. The majority of associated transcription factors show expression in testis tissue. Additionally 6 shared TF modules were identified. One of these is also positionally conserved. The conserved TFBS and shared TF modules lead to a certain degree of co-regulation of both genes in the male germ line. Aside multiple allele-specific repetitive TFBS and TFBS clusters were mapped, which mediate a gene-specific transcriptional control. The combination of computational analysis and selective luciferase reportergene analysis demonstrated an effective strategy for identification of essential cis-control elements of the DDX3(X/Y) germ line expression. Hence, these cis-modules are prime sequence motives for molecular mutation analysis in infertile men with evidence for dysfunction of DDX3(X/Y) gene expression.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Vogt, Prof. Dr. Hans-Peter
Date of thesis defense: 7 September 2011
Date Deposited: 13 Sep 2011 11:17
Date: 2011
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Frauenklinik
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Spermatogenese, Differentielle Genexpression, Promotor <Genetik>, Allel, Geschlechtschromosom, Primaten, Altweltaffen, Evolution
Uncontrolled Keywords: DDX3X , DDX3Y , DEAD-Box RNA-Helikase , Allel-spezifische Promoterevolution , Azoospermia Faktor a DeletionDDX3X , DDX3Y , DEAD-Box RNA helicase , allele-specific promoter evolution , Azoospermia Factor a deletion
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