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Reverse engineering of gene regulatory networks governing cell-cell communication in the microenvironment of pancreatic cancer

Rogon-Lamparski, Zbigniew

German Title: Rekonstruktion der Gen-Regulatorischen Netzwerke zur Verwaltung von Zell Wechselwirkungen in der Umgebung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse

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Abstract

Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the leading causes of cancer death, with a five-year survival rate of <5% and a median survival of 6 months. Extensive desmoplastic reaction is a characteristic feature and a prognostic factor of PDAC, which conveys its resistance. Desmoplastic stroma accounts for approx. 90% of tumor volume and consists predominantly of non-malignant fibroblasts (pancreatic stellate cells, PSC). Previous studies have revealed the PSC mesenchymal origins, capacity to switch between quiescent and activated states, proinflammatory features, expression of soluble factors, ability to migrate, and phagocytize. State of the art: Abundance of stroma has sparked previous attempts to dissect the interactions between PSC and tumor cells (TC) producing a common picture of a microenvironment supporting PDAC development. Unfortunately, focus on snapshot-like analysis has proven difficult to translate into therapeutical advances, as it discards the dynamic interactions in the microenvironment, as well as the temporal dynamics of gene expression itself. Gene regulatory networks (GRN) adapt to environmental cues by rewiring connections between genes, those induced modulations effectively lead to state-transitions e.g. PSC activation, or produce mutually exclusive cell-fate decisions e.g. differentiation, senescence, or death. We recognize that cell-specific assignment of stimuli, identification of genes forming the GRNs, as well as the identification of cellular state-changes remain undiscovered. We hypothesize that at an early stage, the quiescent → activated PSC transition yields a steady state PSC gene regulatory network (GRN), but the subsequent succession of impulse responses along TC→PSC→TC interaction axis drives both cell types into unstable states maintained only for the duration of the direct TC-PSC contact. Aims: Through the application of a high-throughput complexity reduction approach and in silico modeling I aim to reconstruct the GRNs underlying the cell-cell communication, and identify key soluble factors shaping the double-paracrine interactions. I aim to use the models to gain a mechanistic and functional insight into how the cues are integrated and how they affect GRN maintenance. I hope to capture cell-fate decisions and identify key dynamic changes with the ultimate goal of finding genetic markers to aid development of novel therapeutic options for this deadly malignancy. Results: We have individually stimulated PSC and TC with conditioned supernatant from the respective other cell type and recorded a time-series (1-24h) from which genome-wide microarray expression data has been generated. In this dissertation I used the time-resolved expression profiles to identify significant gene kinetics through an approach-involving gene ranking, filtering, and clustering followed by gene ontology and pathway analysis. I identified key gene interactions using a genetic algorithm embedded in a continuous time recurrent neural network (CTRNN) modeling scheme. Then I used the derived GRN’s to produce a picture of unique intercellular interactions. Through in silico simulations with the created models, and subsequent data analysis and interpretation I delivered targets for experimental testing on the inter- as well as intra-cellular levels. Experimental validation of the selected gene targets using gene silencing and qRT-PCR confirmed the in silico predicted TC network behavior; validation of the intercellular connections confirmed their dependence on the identified networks.

Translation of abstract (German)

Hintergrund: Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der führenden Ursachen für Todesfälle durch Krebs, mit einer 5-Jahresüberlebensrate von <5% und einer mittleren Überlebenszeit von 6 Monaten. Umfangreiche desmoplastische Reaktion ist ein charakteristisches Merkmal und ein prognostischer Faktor für PDAC, welches auch dessen therapeutischen Widerstand vermittelt. Desmoplastisches Stroma bildet ca. 90% des Tumorvolumens und besteht überwiegend aus nicht-malignen Fibroblasten (Pankreas Sternzellen, PSC). Frühere Studien haben den mesenchymalen Ursprung dieser Zellen, ihre Fähigkeit zur Umschaltung zwischen ruhendem und aktiviertem Zustand, ihre proinflammatorischen Eigenschaften, die Expression von löslichen Faktoren, und ihre Fähigkeit zu wandern und zu phagozytieren enthüllt. State of the art: Erhebliche Auswirkungen des Stromas auf die Tumorprogression wurden durch frühere Versuche gezeigt. Leider konzentrierten sich diese Studien nur auf eine Momentaufnahme und ignorierten dabei die dynamischen Wechselwirkungen in der Mikroumgebung, sowie die zeitaufgelöste Dynamik der Genexpression selbst was die Umsetzung in Therapieansätze behindert hat. Gen-regulatorische Netzwerke (GRN) passen sich dynamisch an Umweltreize an und Beeinflussen den zellulären Zustand. Diese induzierte Modulation führt effektiv zu Zell Veränderungen (e.g. PSC Aktivierung), oder sogar zu sich gegenseitig ausschließenden Zell-Schicksal Entscheidungen (e.g. Differenzierung, Seneszenz oder Tod). In diesem Zusammenhang blieben die Zell-spezifische Zuordnung von Reizen, die Identifizierung der entsprechenden Gene welche die zugrunde liegenden GRN bilden, sowie die Identifizierung von zellulären Zuständen bislang unerforscht. Wir vermuten, dass in einem frühen Stadium der Tumorentwicklung durch die Aktivierung von PSC ein stabiles GRN Netzwerk hergestellt wird, welches dann aber durch die anschließende Sequenz von Impulsantworten entlang der Tumorzellen (TC)→PSC→TC Interaktions Achse destabilisiert wird. Ziele: Mein Ziel ist es, durch eine Reduktion von Komplexität und den Einsatz von in silico Modellierung die zugrunde liegenden Gen-regulatorische Netzwerke zu rekonstruieren und die Faktoren zu identifizieren, welche für die Doppel-Parakrine Stimulierung der Zellen in dieser Mikroumgebung verantwortlich sind. Ein weiteres Ziel ist es einen mechanistischen und funktionellen Einblick in die Signal Integration und dessen Wartung auf der Gen ebene zu gewinnen. Ich hoffe, die Zell-Schicksal Entscheidungen erfassen zu können und wichtige dynamische Veränderungen zu identifizieren. Dadurch können genetische Marker für die Entwicklung neuer therapeutischer Optionen für diese tödliche Malignität gefunden werden. Ergebnisse: Durch die Stimulierung von PSC und TC durch konditioniertes Medium von dem jeweils anderen Zelltyp wurden zwei Microarray-Expressionsdaten Zeitreihen von 1-24h Experimental aufgenommen. In dieser Arbeit durch den Ansatz von Gen Einstufung, Filtrierung und Clustering identifiziere ich die zeitaufgelösten Genexpressionsprofile welche dann mit Gen-Ontologie und Pathway-Analyse bearbeitet werden. Mit Hilfe eines genetischen Algorithmus in einem zeitverzögerten rekurrenten neuronalen Netz (CTRNN) konnte ich die Schlüssel-Gen Interaktionen erkennen. Die abgeleiteten Netzwerke habe ich dann zur Erzeugung eines Bildes der einzigartigen interzellulären Wechselwirkungen benutzt. Durch in silico Simulationen mit den erstellten Modellen, die anschließende Datenanalyse und Interpretation konnte ich Ziele für die experimentelle Prüfung auf der inter- und intra-zellulären Ebene identifizieren. Experimentelle Validierung der ausgewählten Gen-Targets mit Gen-Stilllegung und qRT-PCR bestätigte das in silico vorhergesagtes Verhalten des TC Netzwerks, zusätzlich konnten wir auch die Abhängigkeit der ausgewählten interzellulären Verbindungen von den identifizierten Netzwerken bestätigen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof.Dr. Roland
Date of thesis defense: 21. September 2011
Date Deposited: 06. Oct 2011 15:02
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Bioinformatik, Bioinformatikstudium, Tumor, Tumor-Nekrose-Faktor, Systembiologie
Uncontrolled Keywords: stroma , Differenzierung , Aktivierung , doppel-parakrinecontinuous time recurrent neural networks , ctrnn , miapaca2 , psc , pancreatic stellate cells
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