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In vitro cell culture systems for the investigation of the morphogen Sonic hedgehog (Shh)

Kwok, Chiu Wai

German Title: In vitro Zellkultursysteme zur Untersuchung des Morphogens Sonic hedgehog (Shh)

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Abstract

Sonic hedgehog (Shh) plays an important role in embryogenesis. It acts as a morphogen that diffuses to form a concentration gradient and works in a temporally and spatially controlled manner. Shh not only regulates organogenesis, such as formation of digits on limbs and organization of the brain, but also controls cell division of stem cells. Perturbations in Shh signaling have been implicated in developmental disorders and development of some cancers. However, owing to the dynamic in vivo environment and the high degree of complexity of the molecular processes and transports, there are challenges of investigating the cell-Shh interactions. Controlled immobilization of proteins like cell adhesion proteins, immunoglobulins, hormones, morphogens, including Shh, is an essential step for a large set of applications in biology, medicine and biotechnology ranging from developmental biology to tissue engineering and biosensing. Reliable attachment of biomolecules on solid man-made substrates opens routes for many new key experiments, allowing studies of the biomolecules in simplified and thus controllable conditions. By taking advantage of the immobilization models for studying complicated biological events, the objective of the current project was to organize Shh in vitro in a way mimicking the in vivo microenvironment, in which the morphogen is distributed with a concentration gradient extracellularly. The immobilization processes have to show selective binding chemistry, provide control of the positioning and orientation of Shh on the substrate, and need to allow access of Shh to its receptor. In the presented project, biologically active Shh protein variants were synthesised in vitro. Plasmids of Shh with different tags or linker groups for immobilization were made. Production of sufficient amount of Shh for immobilization and surface analysis was performed in the E. coli expression system; while the determination of biological activity of Shh was carried out with the proteins obtained from the HEK293 cell culture system. The C3H10T1/2 clone 8 and the Shh LIGHT II cells demonstrated that the in vitro expressed Shh proteins are biologically active. The Shh induced cellular responses are dosage dependent. Adsorption or immobilization of Shh on substrates by a variety of physical and chemical interactions was then developed and tested. These interactions include collagen matrix networking; nickel(II)/poly(6)histidine affinity; biotin/streptavidin affinity; and benzylguanine (BG)/SNAPTM covalent binding. Each of them exhibits different binding strength. Surface analysis illustrated that all of the applied systems are capable of immobilizing Shh by physisorption or chemical binding. Collagen permits motility of the adsorbed Shh. The biological activity of the protein is maintained to induce Shh signal specific cellular responses. The nickel(II)/poly(6)histidine and biotin/streptavidin systems facilitate Shh binding with high selectivity. The BG/SNAPTM approach promotes specific and irreversible immobilization of Shh. Further experiments are under progression for the establishment of a tailor-made platform for the in vitro investigation of the interaction of irreversibly bound Shh with the responsive cells.

Translation of abstract (German)

Das Signalprotein "Sonic hedgehog" (Shh) spielt eine bedeutende Rolle in der Embryogenese. Es fungiert als Morphogen: Das von einer lokalen Quelle aus diffundierende Molekül bildet einen Konzentrationsgradienten aus, dessen räumliche und zeitliche Ausprägung die Zellentwicklung steuert. Shh steuert nicht nur die Organentwicklung wie beispielsweise das Ausbildung von Gliedmaßen und die Organisation des Gehirns, sondern auch die Zellteilung von Stammzellen. Störungen des Sonic hedgehog Signalwegs führen zu Fehlbildungen in der Embryonalentwicklung und werden mit dem Auftreten bestimmter Krebsarten in Zusammenhang gebracht. Aufgrund der großen Dynamik im lebenden Organismus und der hohen Komplexität der Prozesse auf molekularer Ebene, ist die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Zellen und Shh oft schwierig. Die kontrollierte Immobilisierung von Proteinen wie Zelladhäsionsproteine, Immunoglobuline, Hormone, Morphogene wie Shh ist ein essentieller Schritt in zahlreichen und ganz verschiedenen biologischen, medizinischen oder biotechnologischen Anwendungen wie beispielsweise Entwicklungsbiologie, Tissue Engineering und Biosensorik. Eine gezielte Anbindung von Biomolekülen an feste, künstliche Substrate ermöglicht viele neue Schlüsselexperimente, die es erlauben Biomoleküle unter einfachen – und daher kontrollierbaren – Bedingungen zu untersuchen. Gemäß diesem Ansatz war es das Ziel dieser Arbeit einen Konzentrationsgradienten wie ihn das Morphogen Shh in seiner Mikroumgebung in vivo ausbildet in vitro nachzubilden. Dafür muss der chemische Immobilisierungsprozess selektiv sein und es erlauben Position und Orientierung von Shh auf dem Substrat zu steuern, so dass eine Bindung zwischen Shh und seinem Rezeptor möglich ist. In diesem Projekt wurde biologisch aktives Shh in vitro hergestellt. Dazu wurden Plasmide erzeugt, deren Sequenz Shh mit verschiedenen Tags und Linkern zur Immobilisierung enthält. Größere Mengen an Shh für Immobilisierungsversuche und Experimente zur Quantifizierung immobilisierten Proteins wurden in E. coli exprimiert. Versuche zur Bestimmung der biologischen Aktivität des Proteins wurden mit Shh durchgeführt, das mit Hilfe des HEK293 Kultursystems erhalten worden war. Zwei verschiedene Zellkultursysteme wurden herangezogen, um die biologische Aktivität des exprimierten Proteins zu verifizieren: C3H10T1/2 Klon 8 und Shh LIGHT II. Die durch Shh induzierten Zellantworten waren dosisabhängig. Anschließend wurden verschiedene Verfahren zur Adsorption oder Immobilisierung von Shh auf künstlichen Substraten mittels physikalischer bzw. chemischer Methoden entwickelt und getestet. Zu den untersuchten Immobilisierungsstrategien gehörte Adsorption an vernetzte Kollagenmatrix, Affinitätsbindung über Ni2+/Poly(6)histidin bzw. Biotin/Streptavidin und kovalente Bindung von Benzylguanin (BG) an SNAPTM-tragende Moleküle. Die Bindungsstärke variiert je nach Methode. Mittels Oberflächenanalyse konnte gezeigt werden, dass alle verwendeten Systeme in der Lage waren Shh zu adsorbieren bzw. zu binden. Die Kollagenmatrix erlaubt eine gewisse Mobilität des adsorbierten Shh. Die biologische Activität des Proteins blieb erhalten: Das Shh-Signal war in der Lage spezifische Zellantworten zu induzieren. Sowohl das Ni2+/Poly(6)histidin als auch das Biotin/Streptavidin System ermöglichen eine hochselektive Bindung. Die Kopplung mit BG/SNAP führt zu spezifischer und irreversibler Immobilisierung von Shh. Weitere Experimente zielen auf die Entwicklung einer maßgeschneiderten Plattform ab, welche die Grundlage für die in vitro Untersuchung der Wechselwirkungen von immobilisierten Shh mit Shh-sensitiven Zellsystemen sein wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Strähle, Prof. Dr. Uwe
Date of thesis defense: 16. November 2011
Date Deposited: 25. Nov 2011 14:29
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Sonic hedgehog , Surface modifications , Protein immobilization
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