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The role of phosphorylation in the Schizosaccharomyces pombe EB1 homolog mal3p

Feijão, Andréia

German Title: Die Rolle der phosphorylierung in der Schizosaccharomyces pombe EB1 homolog mal3p

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Abstract

Mikrotubuli sind hochdynamische Polymere, die wesentliche Funktionen in einer Reihe von grundlegenden zellulären Prozessen haben. Zum Beispiel sind das Generieren und Erhaltenvon Zellpolarität, die Chromosomensegregation während der Mitose oder die Positionierung und der Transport von Organellen ohne Mikrotubuli nicht möglich. Um all diese Aufgaben zu erfüllen, müssen Mikrotubuli Organisation und Dynamik genau geregelt werden. Angehörige der EB (end binding) Proteinfamilie sind vor kurzem als zentrale Regulatoren der wachsenden Mikrotubuli Plus-Enden bekannt geworden. Trotzdem sind die molekularen Mechanismen, welche die vielfältigen Aktivitäten dieser Proteine in den verschiedenen biologischenZusammenhängen und Prozessen kontrollieren noch weitgehend unverstanden. In dieser Studie zeigen wir, dass mal3p, das EB1 (end binding protein 1) Homologe der Spalthefe, an einem Cluster von fünf Serinen phosphoryliert wird. Das Cluster liegt in einer flexiblen Proteinregion, welche die mikrotubulibindende Calponinhomologie-domäne mit der konservierten EB1-Domäne verbindet. Von den Serinen sind S144 und S145 „dominant“, da die Absenz von Phosphorylierung an diesen Serinen, die Phosphorylierung der Serine S147, S148 und S151 verhindert. Darüber hinaus zeigen wir, daß sich die Phosphorylierung von mal3p während des Zellzyklus in einem bestimmten Muster ändert. Dabei ist mal3p am Übergang von der Interphase zur Mitose dephosphoryliert. Zu diesem Zeitpunkt bilden sich anstelle der zytoplasmatischen Interphasenmikrotubuli, intranukleäre Mikrotubuli welche die mitotische Spindel aufbauen. Mal3p wird anschließend, am Übergang von der Metaphase zu Anaphase, wieder phosphoryliert. Das geschieht wenn die Spindelmikrotubuli stabilisiert werden müssen damit die Spindel sich verlängern kann. Diese mal3p Phosphorylierung scheint sowohl an der Regulation der Anaphase als auch an der richtigen Mikrotubuli-Organisation im Mittelbereich der Spindel beteiligt zu sein. Parallel zum Phosphorylierungsstand, ist die Menge an mal3p Protein zu Beginn der Mitose am höchsten und nimmt dann während der Mitose sukzessive ab wobei sie zum Zeitpunktder Zytokinese ein Minimum erreicht. Zusammen mit der Feststellung, daß die mal3p Proteinmenge in mutanten Zellen, in denen mal3p nicht phosphoryliert werden kann, generell erhöht ist, legt dies nahe, daß die Phosphorylierung den mal3p Proteingehalt der Zelle reguliert. Überraschenderweise haben Mikrotubuli in Gegenwart von höheren Mengen von unphosphoryliertem mal3p eine erhöhte Katastrophenrate. Dies widerspricht der bisherigen Ansicht, wonach mal3p Protein für Mikrotubuli wachstumsfördernd ist. Unsere Ergebnisse geben somit neue Einblicke in die pleiotropen Funktionen der EB1 Proteine und in die regulatorischen Mechanismen, die diese Funktionen kontrollieren.

Translation of abstract (English)

Microtubules are highly dynamic polymers that have widespread, essential functions in a number of fundamental processes, such as the establishment and maintenance of cell polarity,chromosome segregation during mitosis, and organelle positioning and transport. In order to perform all these functions, microtubule organization and dynamics have to be precisely regulated. Members of the end binding (EB) protein family have recently emerged as master regulators of growing microtubule plus-ends, but the molecular mechanisms controlling the multiple activities of these proteins in the various biological contexts and processes in which microtubules participate are poorly understood. In this study we show that mal3p, the fission yeast end binding protein 1 (EB1) homologue, is phosphorylated on a cluster of five serine residues lying in the flexible linker region that connects the microtubule binding calponin homology domain with the conserved EB1 domain. From these sites, S144 and S145 are “dominant”, since the lack of phosphorylation at these sites impairs phosphorylation of S147, S148 and S151. Furthermore, we show that phosphorylation changes in a cell cycle-dependent manner. Mal3p is dephosphorylated at the transition from interphase to mitosis, when the intranuclear microtubule spindle needs to form while cytoplasmic microtubule nucleation ceases. Mal3p subsequently becomes phosphorylated again at the transition from metaphase to anaphase, when spindle microtubules become stabilized to allow for spindle elongation. This phosphorylation appears to be involved in the regulation of spindle elongation and proper microtubule organization in the spindle mid-zone. Concomitant with the phosphorylation states, mal3p levels are highest at mitotic onset and decrease during mitosis, reaching a minimum at the time when cytokinesis occurs. Together with the finding that mal3p protein levels are much increased in the absence of phosphorylation, these results suggest that mal3p phosphorylation regulates overall mal3p protein levels in a cell cycle-dependent manner. Surprisingly, microtubules have higher catastrophe rates when mal3p protein levels increase, which contradicts the proposed microtubule growth-promoting activity of mal3p. Our findings thus reveal new insights into the pleiotropic functions of the EB1 protein family members and into the regulatory mechanisms that modulate these functions.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gruss, Prof. Dr. Oliver
Date of thesis defense: 17. November 2011
Date Deposited: 25. Nov 2011 14:19
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: mal3p, EB1, pombe, mikrotubuli, phosphorylierung
Uncontrolled Keywords: mal3p , EB1 , pombe , mikrotubuli , phosphorylierungmal3p , EB1 , pombe , microtubules , phosphorylation
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