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Analyse der Redundanz von SHOX und SHOX2 und Identifizierung von Shox2-Zielgenen

Glaser, Anne

English Title: Analysis of the redundancy of SHOX and SHOX2 and identification of Shox2 target genes

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PDF, German
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Abstract

Die paralogen Gene SHOX und SHOX2 kodieren für Homöodomänen-Transkriptionsfaktoren mit wichtigen Funktionen innerhalb der Embryonalentwicklung. SHOX wurde als menschliches Wachstumskontrollgen identifiziert. Mutationen dieses Gens führen zu den skelettalen Fehlbildungen, die bei Léri-Weill-, Langer-, und Turner-Syndrom beobachtet werden, und sind zudem mit isoliertem Kleinwuchs assoziiert. Analysen mit Hilfe des Mausmodells zeigten, dass Shox2 ebenfalls eine entscheidende Rolle in der Entwicklung der Extremitäten spielt und darüber hinaus für weitere Prozesse, wie z.B. die Herzentwicklung erforderlich ist. Funktionelle Analysen beider Gene ergaben weitgehende Übereinstimmungen hinsichtlich ihrer Expression, subzellulären Lokalisierung, DNA-Bindung sowie ihrer transaktivierenden Eigenschaften. Diese Befunde sprechen für überlappende Funktionen beider Gene. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Redundanz beider Gene mit Hilfe des Maus- und des Hühnermodells genauer zu untersuchen. Da die Maus kein SHOX-Ortholog besitzt, wurde eine targeting-Strategie entwickelt, um menschliches SHOX unter dem endogenen Shox2-Promotor in die Maus einzubringen und gleichzeitig Shox2 auszuschalten. Dieses Shox2-knockout / SHOX-knockin-Mausmodell würde ein geeignetes Modell darstellen, um die gemeinsamen Funktionen beider Gene zu untersuchen, allerdings war dessen Generierung im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Daher wurde die Redundanz von Shox und Shox2 mit Hilfe vergleichender Expressionsanalysen in Maus und Huhn untersucht. Es zeigte sich dabei, dass Shox und Shox2 in unterschiedlichen Bereichen des Kiefers und der Extremitäten exprimiert sind. Im Nervensystem stimmen die Expressionsmuster beider Gene weitgehend überein, wobei Shox2 etwas breiter exprimiert ist. Dies spricht für gemeinsame Funktionen beider Gene und könnte erklären, warum der Verlust von SHOX bisher mit keinem menschlichen neuronalen Phänotyp in Verbindung gebracht werden konnte. Möglicherweise kann SHOX2 bei einem Verlust des SHOX-Gens die Funktion in der neuronalen Entwicklung vollständig übernehmen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von Shox2 in der murinen Gliedmaßenentwicklung näher untersucht. Um Einblicke in Shox2-abhängige Signalwege zu erlangen sollten Zielgene von Shox2 isoliert werden. Mit Hilfe von microarray-Analysen und nachfolgenden qRT-PCR-Analysen wurde Tbx4 als interessantestes Kandidatengen identifiziert. Unter Verwendung des Shox2-knockout-Mausmodells konnte durch whole mount in situ Hybridisierungen und quantitative Analysen gezeigt werden, dass Shox2 die Expression von Tbx4 spezifisch in den Vordergliedmaßen beeinflusst. Nachfolgende Experimente mit Hilfe eines Tbx4-defizienten Mausmodells ergaben wiederum, dass Tbx4 Shox2 in Vorder- und Hinterbeinen positiv reguliert und es sich bei dem zuvor beobachteten Effekt von Shox2 auf Tbx4 wahrscheinlich um einen feedback-Mechanismus handelt. Luziferase-Assays und EMSA-Studien zeigten außerdem, dass es drei TBX4-Bindestellen im genomischen Promotorbereich von SHOX2 gibt und es sich bei dem Einfluss von Tbx4 auf Shox2 um eine direkte Regulation handelt. Damit konnte Tbx4 im Rahmen dieser Arbeit als erster direkter Regulator von Shox2 in der Gliedmaßenentwickung charakterisiert werden, was auf eine mögliche Rolle von Shox2 bei der Initiation des Auswachsens und der Identitätsgebung von Extremitätenknospen hinweist. Weiterhin trägt die Regulation von Shox2 durch Tbx4 zur Aufklärung der Tbx4-involvierten Signalwege in Prozessen wie Muskel- und Skelettentwicklung bei. Erstmalig konnte damit die Beteiligung von Shox2 an einem transkriptionellen feedback-Mechanismus demonstriert werden.

Translation of abstract (English)

The parologous genes SHOX and SHOX2 code for homeodomain transcription factors with important functions during embryonal development. SHOX was identified as the first human growth control gene. Mutations in this gene lead to the skeletal deformities seen in Léri-Weill, Langer and Turner syndrome as well as idiopathic short stature. Analysis of Shox2 knockout mouse models has revealed that Shox2 also plays a crucial role in limb development as well as embryonic heart development. Functional analyses of both genes have revealed that the expression, subcellular localisation, DNA binding and transactivating properties of Shox and Shox2 overlap to a large extent. These data suggest that these two genes have overlapping functions. One goal of this work was to investigate the redundancy of Shox and Shox2 using mouse and chicken models. As the mouse has no Shox ortholog, I developed a targeting strategy to bring human Shox into the mouse under the control of the endogenous Shox2 promoter, thereby knocking out Shox2. This Shox2 knockout / Shox knockin mouse model would provide an excellent model with which to study the redundancy of Shox and Shox2 but the generation of this model was not possible in this work. Therefore I chose to investigate the redundancy of Shox and Shox2 by comparative expression analyses in mouse and chicken. These analyses revealed that Shox and Shox2 are expressed in different regions of the jaw and limbs. In the nervous system the expression patterns of both genes are largely overlapping, although Shox2 expression was more ubiquitous. This indicates redundant functions for both genes; Shox2 could compensate for the loss of Shox in developing neuronal tissues. In the second part of my thesis, I investigated the role of Shox2 in limb development. In order to gain insight into Shox2 dependent signalling pathways, I wanted to uncover potential target genes of Shox2. Using microarray and qRT-PCR, Tbx4 was identified as the most interesting candidate gene. By analysing Tbx4 expression in Shox2 mutant mice using whole mount in situ hybridisation and quantitative analysis I was able to confirm that Shox2 regulates Tbx4 specifically in the forelimbs. Subsequent experiments using Tbx4 deficient mice in turn revealed that Tbx4 positively regulates Shox2 in both fore and hindlimbs. Taken together, these results show that the effect of Shox2 on Tbx4 is possibly a feedback mechanism. Luciferase assays and EMSA studies identified three TBX4 binding sites in the genomic promoter region of SHOX2 demonstrating that TBX4 has a direct effect on SHOX2. In conclusion, my work has identified Tbx4 as the first direct regulator of Shox2 in limb development and has uncovered a possible role for Shox2 in the initiation and identity of the limb buds. In addition, the regulation of Shox2 by Tbx4 provides further insight into Tbx4 related signalling pathways in developmental processes such as muscle and skeletal development. This work has also revealed the involvement of Shox2 in a feedback mechanism for the first time.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Steinbeisser, Prof. Dr. Herbert
Date of thesis defense: 7 October 2011
Date Deposited: 12 Jan 2012 10:42
Date: 2011
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Humangenetik
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Embryonalentwicklung, Entwicklungsgenetik, Homöobox, Maus
Uncontrolled Keywords: Extremitätenentwicklung , SHOX , SHOX2 , Transkriptionsfaktorhomeodomain transcription factor , limb development , mouse, SHOX , SHOX2
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