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Tetracycline-controlled inducible gene expression systems to manipulate neuronal circuits in the mammalian brain

Dogbevia, Godwin Kofi

German Title: Tetrazyklin-kontrollierte, induzierbare Genexpressionssysteme zur Manipulation neuronaler Netzwerke in Säugerhirnen

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Abstract

Regulatable control of gene expression in the mammalian brain is of tremendous importance in understanding the role of neural circuits in the processing, storage and retrieval of information. To understand the fundamental molecular mechanisms underlying these processes, there is the need to develop diverse molecular genetic tools that allow for conditional gene regulation in the central nervous system. To address this issue, we have developed recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) equipped with tetracycline (Tet)-controlled genetic switches to inducibly and reversibly manipulate neural circuits, in the mammalian brain. The present work focused on three objectives: In the first part, long-term, Tet-controlled gene regulation in neurons was investigated. In this part, the rAAV system was used to study the kinetics of Tet-controlled gene regulation in vitro and in vivo using the firefly luciferase reporter assay. Furthermore, repeated cycles of gene activation and inactivation in vivo were also demonstrated. In the second part, inducible, subregion- and cell type-restricted gene recombination and gene knockout in the mouse brain was investigated by employing the rAAV system expressing the site-specific Cre recombinase enzyme and a red fluorescent marker protein under Tet control. Conditional and region-specific gene recombination in transgenic reporter mice was carried out by either targeting the viruses to the hippocampus, cortex or both. Gene recombination occurred in these regions only upon Doxycycline (Tet derivative) injection. With the rAAV and Tet-controlled inducible gene expression systems, the N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptors were knocked out in the barrel field. We clearly demonstrated by electrophysiology that loss of NMDA receptors took place after one week of Dox treatment. With the inducible knockout approach, we are currently investigating the function of NMDA receptors in acquisition and maintenance of associative learning and memory. In the last part, inducible and reversible silencing of synaptic transmission was investigated with the use of tetanus toxin light chain (TeTxLC). By reversible silencing of synaptic transmission with TeTxLC, the role of neurons from different brain regions in memory consolidation processes and behavior will be investigated. With this approach, we have demonstrated that TeTxLC expression results in silencing of synaptic transmission. Moreover, by expressing the TeTxLC in the striatum of the mouse brain, a behavioral phenotype was produced, which was reversed by Dox administration. The original TeTxLC has a long half-life thus, very slow off rate. To reduce the half-life of the TeTxLC, new variants of TeTxLC were generated, named fast one (F1-TeTxLC) and fast two (F2-TeTxLC). With these new variants of TeTxLC, we observed that reversible silencing of synaptic transmission took place within 3 weeks with F1-TeTxLC and less than two weeks with F2-TeTxLC in vivo. We also demonstrated synaptic silencing in organotypic brain slices 24-48 hours after Dox treatment in vitro. A combination of these newly developed genetic tools will be of great advantage to investigate the role of neural circuits in learning, memory consolidation and behavior.

Translation of abstract (German)

Um besser verstehen zu können, wie neuronale Schaltkreise Informationen prozessieren, speichern und abrufen, ist es von großer Bedeutung, die Expression bestimmter Gene im Gehirn regulieren zu können. Daher bedarf es der Entwicklung verschiedener genetischer Werkzeuge um konditionale Genexpression zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurden rekombinante adenoassoziierte Viren (rAAV) entwickelt, die mit Tetracyclin (Tet)-regulierten genetischen Sequenzen ausgestattet sind. Mit Hilfe dieser Technik ist es möglich, Neurone oder Netzwerke von Neuronen im Gehirn von Säugetieren reversibel und induzierbar zu manipulieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit drei Fragestellungen. Im ersten Abschnitt wurde über längere Zeit die Tet-kontrollierte Genregulation in Neuronen untersucht. In diesem Abschnitt wurde das rAAV-System verwendet, um die Kinetik der Tet-abhängigen Genexpression in vitro und in vivo mit Hilfe des “firefly luciferase” Reporter-Assays zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die Genexpression zyklisch An-und Abschalten lässt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich induzierbare Gen-Rekombination und Gen „Knock-out“ auf spezielle Hirnregionen und Zelltypen eingrenzen lassen. Dafür wurde ein Tet-induzierbares rAAV-System entwickelt, welches neben der Sequenz-spezifischen Cre-Rekombinase auch ein rot-fluoreszierendes Protein exprimiert. Für die konditionale Gen-Rekombination wurden der Hippocampus, der Kortex oder beide Hirnregionen von transgenen Reporter-Mäusen mit Viren injiziert. Die Gen-Rekombination erfolgte in diesen Regionen in Abhängigkeit der Zugabe von Doxyciclin, eines Tet-Derivates. Darüber hinaus wurde mit diesem rAAV-System der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptor im Barrel-Kortex deletiert. Mit Hilfe elektrophyisologischer Studien konnte bereits eine Woche nach Dox-Gabe eine Reduktion des NMDAR-Levels festgestellt werden. Mit diesem System kann die Funktion des NMDAR bei der Erlernung und Aufrechterhaltung assoziativer Gedächtnisinhalte erforscht werden. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, mit welcher durch Expression der kleinen Untereinheit von Tetanus Toxin (TeTxLC) die synaptische Transmission reversibel und induzierbar gehemmt werden kann. Dieses System ermöglicht die Erforschung der Funktion spezifischer Neuronenpopulationen bei Prozessen der Gedächtniskonsolidierung und des Verhaltens. Es konnte gezeigt werden, dass die synaptische Transmission durch Expression von TeTxLC gehemmt wird. Durch Expression von TeTxLC im Striatum wurde bei Mäusen ein Verhaltens-Phänotyp erzeugt, welcher durch Gabe von Dox revidiert werden konnte. Das anfänglich entwickelte TeTxLC hat eine lange Halbwertszeit und somit eine sehr langsame Aktivitätsabnahme. Um die Halbswertszeit des TeTxLC-Proteins zu verringern wurden zwei weitere Varianten des TeTxLC-exprimierenden Systems generiert, fast one (F1-TeTxLC) und fast two (F2-TeTxLC). Mit diesen neuen Varianten konnte die Aufhebung der induzierten Hemmung der synaptischen Transmission signifikant verkürzt werden: auf drei Wochen mit F1-TeTxLC und weniger als zwei Wochen mit F2-TeTxLC. Darüber hinaus konnten wir synaptische Hemmung in organotypischen Gehirnschnitten 24-48 Stunden nach Behandlung mit Dox in vitro nachweisen. Die Kombination dieser neu entwickelten genetischen Werkzeuge wird sehr nützlich sein zur Erforschung der Funktion neuronaler Netzwerke beim Lernen, der Gedächtniskonsolidierung und des Verhaltens.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Seeburg, Prof. Dr. Peter
Date of thesis defense: 28 November 2011
Date Deposited: 08 Dec 2011 14:09
Date: 2011
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Tetracycline , gene expression
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