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Characterization of human Pat1b, an essential P-body protein that links deadenylation to decapping in 5’ to 3’ mRNA decay

Özgür, Sevim

German Title: Charakterisierung von humanem Pat1b, einem essentiellen P-body protein, das zwei Schritte im 5' zu 3' mRNA Abbauprozess, Deadenylierung und Decapping, miteinander verknüpft

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Abstract

In eukaryotic cells, degradation of many mRNAs is initiated by removal of the polyA tail followed by decapping and 5’ to 3’ exonucleolytic decay. Although the order of these events is well established, we are still lacking a mechanistic understanding of how deadenylation and decapping are linked. During my PhD studies, I characterized the human Pat1b protein and showed that Pat1b links the deadenylation complex to the decapping complex both physically and functionally. Pat1b is tightly associated with the Ccr4-NOT deadenylation complex as well as with the Dcp1-Dcp2 decapping complex. In addition, Pat1b overexpression increases the association of the deadenylation complex with the decapping complex. When tethered to a reporter mRNA, Pat1b induces its rapid degradation. Pat1b-mediated mRNA decay depends on the deadenylase Caf1a and the decapping enzyme Dcp2, indicating that these interactions are functionally important. Moreover, Pat1b interacts with the decapping enhancers Rck, the Lsm1-7 complex, Hedls and Edc3. Pat1b interacts with the deadenylation complex, the decapping complex and the decapping enhancers via at least three different domains, suggesting that Pat1b serves as a scaffolding protein. Together, the data provide evidence that human Pat1b is a central component of the mRNA decay machinery that connects deadenylation with decapping. Most enzymes of the 5’ to 3’ mRNA decay pathway, including the Ccr4-NOT deadenylation complex, are localized in cytoplasmic foci called processing (P) bodies. I could show that Pat1b is required for P-body formation, and that it strongly induces P-body numbers when overexpressed. My data indicate that an amino-terminal region within Pat1b serves as an aggregation-prone domain that nucleates P-bodies, whereas an acidic domain controls the size of P-bodies. Although Rck specifically interacts with the acidic domain of Pat1b, point mutations in Pat1b that abolish the Rck interaction did not alter P-body size. On the other hand, I also identified point mutations in Rck that abolish Pat1b binding, and found that Rck needs to associate with PAt1b in order to promote P-body formation. Furthermore, I purified Pat1b and identified additional binding partners via mass spectrometry. Further characterization of these interactions may help to understand how Pat1b controls P-body numbers and size, and what additional functions Pat1b may have.

Translation of abstract (German)

In eukaryontischen Zellen wird der Abbau vieler mRNAs mit der Entfernung des Poly(A)-Schwanzes initiiert, wonach das Cap am 5’ Ende entfernt und anschließend der Rest der mRNA exonukleolytisch vom 5’ zum 3’ Ende abgebaut wird. Obwohl die Reihenfolge dieser Vorgänge sehr gut beschrieben ist, ist bis heute wenig bekannt über den genauen Mechanismus, der Deadenylierung und Decapping verbindet. In meiner Doktorarbeit habe ich das humane Protein Pat1b charakterisiert und konnte zeigen, dass Pat1b den Deadenylierungs-Komplex sowohl physisch als auch funktionell mit dem Decapping-Komplex verbindet. Pat1b ist zum einen stark mit dem Ccr4-NOT Deadenylierungs-Komplex, zum anderen aber auch mit dem Dcp1-Dcp2 Decapping-Komplex assoziiert. Zudem verstärkt die Überexpression von Pat1b die Kopplung von Deadenylierung und Decapping. Wenn Pat1b experimentell an eine Reporter-mRNA gebunden wird, induziert Pat1b den schnellen Abbau dieser mRNA. Pat1b vermittelter mRNA-Abbau hängt von der Deadenylase Caf1a und dem Decapping-Enzym Dcp2 ab, was darauf hindeutet, dass die Interaktion mit Pat1b wichtig ist für deren Funktion. Darüber hinaus interagiert Pat1b mit den Proteinen Rck, Hedls, Edc3 und dem Lsm1-7 Komplex, die den Decapping-Prozess fördern. Pat1b assoziiert mit dem Deadenylierungs-Komplex, dem Decapping-Komplex und weiteren Decapping-Proteinen über mindestens drei verschiedene Domänen, was darauf schließen lässt, dass Pat1b eine Plattform-Funktion einnimmt. Zusammenfassend liefern diese Daten Hinweise darauf, dass das humane Pat1b eine zentrale Komponente der mRNA-Abbaumaschinerie ist, die Deadenylierung mit Decapping verbindet. Die meisten Enzyme, die beim mRNA Abbau vom 3’ zum 5’ Ende beteiligt sind, einschließlich dem Ccr4-NOT-Komplex, lokalisieren in zytoplasmatischen Foci, sogenannten Processing Bodies (PBs). Ich konnte zeigen, dass Pat1b notwendig ist für die Bildung von PBs, und dass die Überexpression von Pat1b die Anzahl an PBs erhöht. Meine Daten weisen darauf hin, dass ein Bereich am aminoterminalen Ende von Pat1b als aggregationsfördernde Domäne dient, die zur PB-Bildung führt, während ein anderer Bereich, der mehrere saure Aminosäuren enthält, die Größe der PBs kontrolliert. Obwohl Rck spezifisch mit eben dieser sauren Domäne in Pat1b interagiert, zeigten Punktmutationen in Pat1b, die die Interaktion mit Rck verhindern, keinen Einfluss auf die PB-Größe. Andererseits konnte ich durch Punktmutationen in Rck, die die Assoziation mit Pat1b verhindern, zeigen, dass die Interaktion von Rck und Pat1b für die Bildung von PBs benötigt wird. Außerdem konnte ich Pat1b aufreinigen und mittels Massenspektrometrie weitere Proteine identifizieren, die mit Pat1b interagieren. Die genauere Charakterisierung dieser Interaktionen könnte helfen zu verstehen, wie Pat1b die Anzahl und Größe von PBs kontrolliert, und welche zusätzlichen Funktionen Pat1b noch haben könnte.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Clayton, Prof. Dr. Christine
Date of thesis defense: 15. December 2011
Date Deposited: 12. Jan 2012 09:56
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Deadenylierung
Uncontrolled Keywords: Pat1b , mRNA abbau , Decapping , P-bodyPat1b , mRNA decay , decapping , deadenylation , P-body
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