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Limits of the fish embryo toxicity test with Danio rerio as an alternative to the acute fish toxicity test

Henn, Kirsten

German Title: Grenzen des Fischembryotoxizitätstest mit Danio rerio als Alternative zum akuten Fischtoxizitätstest

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Abstract

As a consequence of current development in European chemical legislation, alternative methods in ecotoxicology gain more and more importance in chemical risk assessment. As an alternative to chemical testing with adult fish, the fish embryo toxicity test (FET) with Danio rerio is considered since a general correlation between both protocols is very high. However, for a couple of outliers the FET were less sensitive than the conventional fish test. To contribute to the clarification, to which extent protection of the embryo by the chorion is responsible for such deviations, the available information on the genesis and morphology, chemical composition, biological function and permeability of the fish chorion was reviewed under toxicological aspects. With regard to possible chemical interactions between chorion components and xenobiotics, there is still a need for supplementary research, particularly on understanding the function and properties of the pores which disperse across fish chorions. Nevertheless, it seems that the chorion is not a major barrier for ordinary chemicals; however, there are exceptions, like substances which might form complex or large structures with other similar molecules through chemical interactions such as ionic bonding (e.g. cationic polymers), substances which likely interact with SH-groups (e.g. heavy metals) or large molecules (e.g. polymers) are blocked by the chorion. For further investigations, existing dechorionation methods were evaluated on their applicability in toxicity testing. Thereupon a modified fish embryo test protocol with reproducibly high survival rates following removal of the chorion was established. The effect of dechorionation was demonstrated with the cationic polymer Luviquat HM552, which was thus shown to be blocked by the chorion of intact eggs probably due to its high molecular weight of ~400000 Dalton, but becomes strongly toxic after dechorionation. A “critical” molecular size might lie between 2000 and 3000 Da as demonstrated with experiments using polyethylene glycols. However, a reasonable molecular size cut off value could not be determined, since beside the molecular weight in Dalton or g/mol, a number of other factors contribute to the actual size of a molecule. In order to evaluate if differential uptake, accumulation or metabolization of the test compounds may produce differences between the results of acute fish and fish embryo toxicity, a known outlier, KCl, was investigated in comparison with other potassium and sodium salts in the standard as well as in the prolonged FET, in tests with eleutheroembryos and dechorionated embryos. Results were compared to acute fish toxicity data retrieved from the US EPA Ecotoxicity database and other data on larval toxicity available from the open literature. The results confirmed that the period around hatching is a critical stage during embryogenesis, which should be included in the testing procedure for chemical testing.

Translation of abstract (German)

Als Folge der gegenwärtigen Entwicklungen in der europäischen Umweltpolitikpolitik in Bezug auf Chemikalien gewinnen alternative Methoden der Risikobewertung von Chemikalien in der Ökotoxikologie immer mehr an Bedeutung. So wird etwa erwogen, als Alternativmethode zur Überprüfung von Chemikalien an adulten Fischen künftig den Fischembryotoxizitätstest (FET) mit Danio rerio anzuwenden, da hier eine sehr gute Korrelation zwischen beiden Testsystemen gegeben ist. Allerdings ist der FET für einige „Ausreißer“ unter den Chemikalien weniger empfindlich als der konventionelle Fischtoxizitätstest. Um zu der Klärung der Frage beizutragen, in welchem Ausmaß ein Schutz des Embryos durch das Chorion für solche Abweichungen verantwortlich ist, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die verfügbaren Informationen zur Entstehung und Morphologie, chemischen Zusammensetzung, biologischen Funktion und Durchlässigkeit des Fischchorions unter toxikologischen Gesichtspunkten aufgearbeitet. Für ein besseres Verständnis der chemischen Interaktionen zwischen Bestandteilen des Chorions und Xenobiotika, vor allem in Hinblick auf die Funktion und Eigenschaften der Poren, die sich über die gesamte Oberfläche des Chorions verteilen, bedarf es hier freilich noch ergänzender Forschung. Dennoch scheint bereits jetzt erkennbar, dass das Chorion für gewöhnliche Chemikalien keine Barriere darstellt. Ausnahmen sind lediglich Substanzen, die durch Komplexierung oder durch chemische Interaktion, wie zum Beispiel das Eingehen ionischer Bindungen mit anderen Molekülen, große Strukturen ausbilden können (z.B. kationische Polymere), Substanzen die mit SH-Gruppen interagieren (z.B. Schwermetalle) oder sehr große Moleküle (z.B. Polymere). Diese werden durch das Chorion blockiert. Für weiterführende Untersuchungen wurden zudem bestehende Methoden zur Dechorionierung von Embryonen auf ihre Anwendbarkeit im Rahmen des Toxizitätstests hin überprüft und in der Folge ein modifiziertes Protokoll entwickelt, das eine reproduzierbar hohe Überlebensrate in Folge der Entfernung des Chorions aufweist. Der Effekt des Dechorionierens wurde mit dem kationischen Polymer Luviquat HM 522 demonstriert, für das auf diese Weise gezeigt werden konnte, dass es – vermutlich auf Grund seines hohen Molekulargewichts von ~ 400000 Da – bei intaktem Ei durch das Chorion blockiert wird, aber nach Dechorionierung stark toxisch wirkt. Eine „kritische molekulare Größe“ liegt möglicherweise zwischen 2000 und 3000 Da, wie durch Experimente mit Polyethylenglykolen gezeigt werden konnte. Ein exakter Grenzwert konnte allerdings nicht bestimmt werden, da neben dem Molekulargewicht in Da oder g/Mol auch eine Reihe anderer Faktoren zur tatsächlichen Grüße eines Moleküls beitragen. Um einzuschätzen können, ob unterschiedliche Aufnahme, Akkumulation oder Metabolisierung einer Testsubstanz Unterschiede in den Befunden akuter Fischtoxizitätstest und Embryotoxizität erzeugen, wurde ein bekannter „Ausreißer“, das Salz Kaliumchlorid im Vergleich mit anderen Kalium- und Natriumsalzen in Standard- und verlängerten Fischembryonentoxizitätstests sowie in Eleutheroembryotests und Dechorionierungsversuchen untersucht. Die Ergebnisse wurden mit Daten aus der US EPA Ökotoxizität-Datenbank zur akuten Fischtoxizität und Daten zur Larvaltoxizität aus offen zugänglicher Literatur verglichen. Die Ergebnisse bestätigen, dass die Periode um den Schlupf ein kritisches Stadium während der Embryogenese darstellt, das im Prüfverfahren der Chemikalientestung miteinbezogen werden sollte.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Braunbeck, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 15. December 2011
Date Deposited: 20. Jan 2012 11:03
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Ökotoxikologie , FischembryotoxizitätstestEcotoxicology , Fishembryotoxicitytest
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