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Solid-supported lipid membranes and their response to varied environmental conditions

Kreuzer, Martin

German Title: Festkörper unterstützte Lipidmembranen und ihre Reaktion auf wechselnde Umgebungsbedingungen

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Abstract

Biologische Membranen sind ein Hauptbestandteil von lebenden Organismen. Sie trennen das Zellinnere von dessen Umgebung und wirken als selektiv permeable Barrieren. Solche Membranen können durch Selbstaggregation von Lipiden gebildet werden. Modell-Membranen dieses Typs können verwendet werden um grundlegende strukturelle Prinzipien im Nahbereich von Phasenübergängen zu verstehen und um biologische Phänomene wie die Gelenkschmierung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Lipidbeschichtungen an der Fest-Flüssig-Grenzfläche präpariert und vermessen. Dabei wurden die Reaktionen der Membranen auf unterschiedliche äußere Parameter und die Wechselwirkung mit organischen Molekülen in den Mittelpunkt der Untersuchungen gestellt. Die Rotationsbeschichtung (spin-coating) und die Luftdruckbeschichtung (air-brush) wurden als einfache und zuverlässige Herstellungsverfahren für Modellmembranen eingesetzt. Die Struktur der hergestellten Membranen wurde in Röntgen- (XR) und Neutronenreflektometrie (NR) Experimenten verifiziert. Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde in der oberflächenempfindlichen, abgeschwächten Totalreflexions (ATR) Geometrie eingesetzt, um die Schwingungsmodi der untersuchten Systeme in Kontakt mit Flüssigkeiten zu charakterisieren. Die uneingeschränkte Vergleichbarkeit zwischen ATR-FTIR- und NR-Ergebnissen wurde durch gleichzeitige Messungen an derselben Probe gewährleistet. Dies erforderte die Konstruktion einer externen ATR-FTIR Strahlführung, welche am BioRef-Neutronenreflektometer der BER II Neutronenquelle am Helmholtz-Zentrum Berlin realisiert wurde. Die dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) wurde als eine ergänzende Methode angewandt, um das Verhalten von Membranen in Lösung am Phasenübergang zu untersuchen. Neben vielfältigen Umgebungsbedingungen wie Temperatur- und Druckänderungen, wurden die Beschichtungen in unterschiedlichen Lösungen inkubiert. Darüber hinaus wurde der Einfluss von äußerer Scherung auf die Modellmembranen getestet. Die Stabilität der präparierten DMPC-Lipidbeschichtungen wurde zuerst in reinem Wasser (D2O) verifiziert: Die Beschichtungen sind stabil in der Rippel-Phase der Lipiddoppelschichten. Dies konnte für verschiedene Druck- und Temperaturbedingungen bis hin zu physiologisch relevanten Temperaturen und etwa 100 MPa gezeigt werden. Zudem reagierten die Beschichtungen stabil auf äußere Scherkräfte und hafteten sowohl auf reinen Silizium-Oberflächen als auch auf Oberflächen mit Titanbeschichtung. In der flüssigen Phase der Lipide hingegen lösten sich die oligolamellaren Beschichtungen irreversibel vom Substrat. Der Einfluss des Hauptphasenübergangs auf die Struktur der Beschichtungen wurde mittels einer multilamellaren Lipidbeschichtung gemessen. In der Rippel-Phase sind die Lipidketten in all-trans Konformation, was zu einer erhöhten Schichtdicke der Lipidmembranen beiträgt. Im Vergleich dazu wurde in der flüssigen Phase mit geschmolzenen Lipidketten eine verminderte Schichtdicke gemessen. Darüber hinaus wurden strukturelle Veränderungen der Beschichtung mittels NR beobachtet, die nicht auf das Schmelzen der Lipidketten (gemessen durch ATR-FTIR) zurückgeführt werden können: ein anormales Quellverhalten der Lipiddoppelschichten bei Annäherung an den Hauptphasenübergang. Neben den Messungen in reinem Wasser wurden Lipidbeschichtungen auch in Lösungen aus Hyaluronsäure (HA) in Wasser (D2O) untersucht. Dieses System wurde als ein Modell für Säugetiergelenke verwendet. Es wurde festgestellt, dass HA tiefgreifende Veränderungen der Lipidmembranen verursacht: Bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck entstand eine neue lamellare Phase, in der die Lipiddoppelschichten drastisch an Dicke zugenommen haben. Eine detaillierte Analyse der Streukurven ergab, dass sich HA-Moleküle außerhalb der einzelnen Lipidlamellen in der Nähe der Kopfgruppen anlagern. Das Überschreiten des Hauptphasenübergangs von der Ripple-Phase in die flüssige Phase der Lipidmoleküle führte nicht zum Ablösen der Lipidbeschichtung. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Lipiddoppelschichten mit Lipidketten in geschmolzenem Zustand (gemessen mit ATR-FTIR) an Dicke zunehmen (gemessen mit NR). Es konnte gezeigt werden, dass das Quellen der Lipidbeschichtung durch Zugabe von 1 M Kochsalz in die HA-Wasser-Lösung unterdrückt werden kann. Hiermit verbunden ist die Abschirmung der elektrostatischen Wechselwirkungen im System. Der Einfluss von HA auf die Lipidmembranen wurde qualitativ auf der Basis der DLVO-Theorie unter Berücksichtigung zusätzlicher sterischer Wechselwirkungen diskutiert.

Translation of abstract (English)

Biological membranes are a main component of living organisms. They separate the inside of cells from their surrounding and act as selective permeable barriers. Those membranes are build up by lipid molecules by self-organization processes. Model membranes of that type can not only be used for improved understanding of fundamental structural principles like phase transition behaviour, but also for the investigation of biological phenomena such as joint lubrication. For both purposes, the response of substrate-supported lipid membranes were studied at the solid-liquid interface at varied external parameters and membrane interactions with organic molecules. The spin-coating and air-brush technique were applied as straightforward and reliable preparation methods for these model membranes. The structure of the prepared membranes was characterized in X-ray (XR) and neutron reflectometry (NR) experiments. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was employed in the surface sensitive attenuated total reflectance (ATR) geometry to characterize the vibrational modes of the investigated systems in contact with liquids. The unrestricted comparability of ATR FTIR and NR results was ensured by unified experiments on the same sample at the same time. This required the design of an external ATR-FTIR beam line, which was combined with a neutron reflectometer, resulting in the BioRef instrument at the BER II neutron source at the Helmholtz-Zentrum Berlin. Differential scanning calorimetry (DSC) was applied as a complementary method in order to study the phase transitional behaviour of the corresponding bulk systems. Besides varied environmental conditions including temperature and pressure changes, different solutions were used as incubating liquid phases. Furthermore, the effects of applied shear load on the prepared model membranes were studied. The performed NR experiments revealed the limits of stability of the prepared DMPC lipid coatings incubated in pure water (D2O): The coatings are stable in the ripple phase of the lipid molecules. That could be shown for various combinations of applied temperature and hydrostatic pressure up to physiologically relevant temperatures and approximately 100 MPa, upon exposure to an external shear force and for lipid layers on both silicon and titanium-coated surfaces. However, in the fluid-like phase of the lipid molecules, the oligolamellar DMPC coatings detached irreversibly from the substrates. The strong impact of the main phase transition on the structure of the coating was further seen in a multi-layered lipid system. In the ripple phase, the lipid chains were in all-trans conformation, resulting in an increased lipid membrane thickness. In comparison, in the fluid-like phase with molten lipid chains, a decreased lipid membrane thickness was found. In addition, structural changes of the coating (as seen by NR) were observed, which could not be correlated to the lipid chain melting alone (as seen by ATR-FTIR): An anomalous swelling of the lipid stack of 1-2 Å occurred upon approaching the main phase transition temperature. Further to measurements performed in pure water, solid-supported lipid membrane systems were also studied in solutions of hyaluronic acid (HA) in water. These systems were used as a more elaborate model for mammalian joints. It was found that HA provokes pronounced effects on the lipid model membranes: At room temperature and ambient pressure a new lamellar phase developed in which the lipid stack drastically increased in thickness by 380% with the lamellar order of the lipid molecules preserved. A detailed analysis of the scattering curves revealed an agglomeration of HA molecules outside the individual lipid lamellae, close to the head group regions. Crossing the main phase transition from the ripple to the fluid-like phase of the lipid molecules within the coating did not result in unbinding of the lipid membranes: they remained stable on the substrate. Furthermore, the lipid coating increased in thickness (as seen by NR) with the lipid chains in their molten state (as seen with ATR-FTIR). It was shown that the swelling of the lipid coating could be suppressed by screening the electrostatic interactions of the system by adding salt to the incubating solution of HA in water. The effects on the solid-supported lipid membranes induced by HA could qualitatively be understood on the bases of the DLVO theory taking into account additional steric interactions.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dahint, Prof. Dr. Reiner
Date of thesis defense: 3 February 2012
Date Deposited: 16 Feb 2012 09:09
Date: 2012
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Lipide, Biomembran, Reflektometrie, FT-IR-Spektroskopie, Neutronenstreuung
Uncontrolled Keywords: DMPC , hyaluronic acid , interface , reflectivity , FTIR
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