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Functional Analysis of MicroRNAs as Regulators of Membrane Trafficking

Serva, Andrius

German Title: Funktionale Analyse von microRNAs als Regulatoren des Membrantransports

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Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are a large family of small noncoding RNAs that extensively regulate gene expression in animals, plants and protozoa. The first miRNA was identified in the early 1990s, but it took almost a decade until miRNAs were recognized as key post-transcriptional regulators of gene expression. Despite the rapidly growing list of miRNA-regulated physiological and pathological processes, intracellular membrane trafficking has attracted little interest from scientific miRNA community. Membrane trafficking defines a complex network of pathways, including biosynthetic trafficking and endocytosis that are indispensable for normal cellular functions. Previous studies have analyzed a few miRNAs involved in insulin secretion, however, no systematic investigation of miRNAs as important regulators of membrane trafficking has been performed. The overall aim of this study was to identify miRNAs and their biologically relevant target genes involved in the regulation of membrane trafficking. As tools to modulate miRNA functions, we used synthetic miRNA mimics (pre-miRs) and inhibitors (anti-miRs) to enhance (gain-of-function) and to suppress (loss-of-function) the activity of cellular miRNAs, respectively. As proof of principle, we demonstrated that increased activity of miR-17 family miRNAs accelerates the biosynthetic cargo protein (ts-O45-G) transport and reduces the cellular internalization of DiI-LDL ligand. Taking the advantage of available technological platforms, we designed a gain-of-function large-scale screening to identify miRNAs that affect biosynthetic ts-O45-G transport rate. We showed that 44 out of 470 tested miRNAs induced significant changes in cargo trafficking. Using image analysis platform, we further identified eight miRNAs (miR-30b, -382, -432, -517a, -517b, -517c, -637 and -765) that also showed significant effects on Golgi complex integrity. Importantly, the majority of identified miRNAs are not endogenously expressed in HeLa cells, indicating the need for validation studies in other experimental systems. To identify functionally relevant target genes, we selected miR-17 and miR-517a and performed genome-wide transcriptome analysis 12h, 24h and 48h after transfection with the respective pre-miRs. We identified TBC1D2 and LDLR genes as novel functional miR-17 targets and confirmed that they exert the miR-17-mediated regulation of endocytosis. Further studies are needed to identify target genes responsible for the miR-17-governed acceleration of ts-O45-G to the plasma membrane. In case of miR-517a, we found a set of target genes with functions in 12 membrane trafficking system, however, their functional interplay with miR-517a remains to be confirmed. Bioinformatics analysis of transcriptome profiling data confirmed that the presence of miRNA seed binding site in the 3´UTRs of human mRNAs is an important determinant for functional miRNA:mRNA interaction. Additionally, we demonstrated that the sets of transcripts downregulated at early time points after transfection with pre-miRs have substantially higher fractions of transcripts with miRNA binding sites in their 3´UTRs compared to the transcripts downregulated at late time points. We believe that these findings could contribute to the development of more accurate miRNA target prediction tool, also allowing identification of nonconserved miRNA targets. In conclusion, we have established an experimental platform that consists of (i) a functional screening module to identify miRNAs that affect membrane trafficking, (ii) a microarray module to identify miRNA target genes, (iii) a statistics and bioinformatics module for data analysis and integration and (iv) a target validation module to validate functional links between targets and miRNAs. Using this platform, we identified numerous miRNAs with novel functions in membrane trafficking system. Moreover, we identified and confirmed TBC1D2 and LDLR genes as novel functional targets of miR-17.

Translation of abstract (German)

MicroRNAs (miRNAs) sind eine große Familie kleiner nichtcodierender RNAs, die weitgehend die Genexpression in Tieren, Pflanzen und Protozoen regulieren. Die erste miRNA wurde in den frühen 1990ern identifiziert, aber es dauerte beinahe ein Jahrzehnt bis die miRNAs als Schlüssel-posttranskriptionale Regulatoren der Genexpression begriffen wurden. Trotz der schnell wachsenden Liste von miRNA-regulierten physiologischen und pathologischen Prozesse hat der intrazelluläre Membrantransport wenig Interesse bei der wissenschaftlichen miRNA Gemeinschaft geweckt. Membrantransport definiert ein komplexes Netzwerk von Bahnen, die den biosynthetischen Transport und Endocytose beinhalten, die unentbehrlich für normale zelluläre Funktionen sind. Frühere Studien haben einige miRNAs analysiert, die an der Insulin-Sekretion beteiligt waren, jedoch wurde keine systematische Erforschung von miRNAs als wichtige Regulatoren von Membrantransport durchgeführt. Das allgemeine Ziel dieser Studie war es, miRNAs und ihre biologisch relevanten Zielgene, die in der Regulation des Membrantransports involviert sind, zu identifizieren. Als Werkzeuge zur Modellierung der miRNA-Funktionen verwendeten wir synthetische miRNA mimics (pre-miRs) und Inhibitoren (anti-miRs), um die Aktivität der zellulären miRNAs zu erhöhen (Anstieg der Funktion) oder entsprechend abzuschalten (Verlust der Funktion). Als Beweis zeigten wir, daß die erweiterte Aktivität der miR-17 Familie mRNAs den biosynthetischen Cargo-Protein (ts-O45-G) Transport beschleunigt und die zelluläre Internalisierung von Dil-LDL Liganden reduziert. Indem wir den Vorteil einer verfügbaren Technologieplattform nutzten, entwickelten wir ein gain-of function Hochdurchsatzscreen, um miRNAs zu identifizieren, die eine Auswirkung auf die biosynthetische ts-O45-G-Transportrate haben. Wir zeigten, daß 44 von 470 getesteten miRNAs signifikante Veränderungen im Cargotransport induzierten. Durch Nutzung der Bildanalyse-Plattform identifizierten wir weitere acht miRNAs (miR-30b, -382, -432, -517a, -517b, -517c, -637, -und -765) die auch signifikante Effekte auf die Golgikomplexintegrität zeigten. Es ist wichtig, daß die Mehrheit der identifizierten miRNAs, die nicht endogen in Hela-Zellen exprimiert werden, die Notwendigkeit für Validierungsstudien in anderen experimentellen Systemen zeigen. Um funktionell relevante Zielgene zu identifizieren, selektierten wir miR-17 und miR-517a und führten eine genomweite Transkriptionsanalyse 12h, 24h und 48h nach Transfektion mit den entsprechenden pre-miRs durch. Wir identifizierten TBC1D2- und LDLR-Gene als neue 14 funktionelle miR-17 targets und bestärkten, daß sie die miR-17 -herbeigeführte Regulation der Endozytose gebrauchen. Weitere Studien sind notwendig, um Zielgene zu identifizieren, die verantwortlich sind für die miR-17-beeinflußte Beschleunigung von ts-O45-G zur Plamamembran. Im Fall von miR-517a fanden wir ein Set von Zielgenen mit Funktionen im Membrantransportsystem, jedoch bleibt ihre funktionelle Wechselwirkung mit miR-517a zu bestätigen. Bioinformatikanalyse von Transkriptionsprofildaten bekräftigten, daß die Anwesendheit von miRNA “seed“-Bindungstellen an den 3´UTRs von humanen mRNAs eine wichtige Determinante für miRNA:mRNA funktionelle Interaktion ist. Zusätzlich zeigten wir, daß die Sets von Transkripten, die zu frühen Zeitpunkten nach Transfektion mit pre-miRs substanziell höhere Fraktionen von Transkripten mit miRNA-Bindungsstellen in ihren 3´UTRs aufweisen, verglichen mit den Transkripten, die zu späteren Zeitpunkten runterreguliert wurden. Wir glauben, daß diese Ergebnisse zur Entwicklung von genaueren miRNA Vorhersagetools beitragen könnten, auch könnte es die Identifizierung von unkonservierten miRNA-Targets erlauben. Zum Abschluß etablierten wir eine experimentelle Plattform, die aus einem funktionellen Screening-Modul besteht, um miRNAs zu identifizieren, die eine Auswirkung auf den Memrantransport haben, ein microarray-Modul zur Identifizierung von miRNA Targetgenen, ein statistisches und Bioinformatik-Modul zur Datenanalyse und Integration, ein Target-Modul zur Validierung eines funktionellen Links zwischen Targets und miRNAs zu erzielen. Mittels dieser Plattform identifizierten wir eine Anzahl von miRNAs mit neuen Funktionen im Membrantransportsystem. Außerdem identifizierten und bestätigten wir TBC1D2 und LDLR-Gene als neue funktionelle Targets von miR-17.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 8 February 2012
Date Deposited: 16 Feb 2012 11:57
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > Bioquant
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: miRNS, Membrantransport, Sekretion, Endocytose
Uncontrolled Keywords: microRNA , membrane trafficking , secretion , endocytosis
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