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Zur Rolle des kleinen GTP-bindenden Proteins Arf1 bei der Biogenese von Transportvesikeln

Höhner, Kathrin

English Title: The role of the small GTP-binding protein Arf1 in transport vesicle biogenesis

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Abstract

Die minimale Maschinerie von COPI-Vesikeln besteht aus dem kleinen Guaninnukleotid-bindende Protein (GNBP) Arf1, dem Hüllproteinkomplex Coatomer und Proteinen der p24-Familie. Trotz umfassender biochemischer Studien sind bis heute die Schritte der COPI-Vesikelbiogenese nicht im Detail aufgeklärt. So ist für das kleine GNBP Arf1 bekannt, dass nach GEF-vermitteltem Nukleotidaustausch an Membranen Konformationsänderungen auftreten, die unter anderem das Ausklappen der amphiphilen N-terminalen alpha-Helix mit ihrem Myristoyl-Anker bewirken, die in die Membran inserieren (Antonny et al., 1997; Franco et al., 1996). Hier dimerisiert Arf1wt, die Mutante Arf1Y35A jedoch nicht. Diese Mutante ist zudem nicht in der Lage, freie COPI-Vesikel zu generieren (Beck et al., 2008). Es ist bisher noch nicht bekannt, wann die Dimerisierung erfolgt und wie die Dimer-Interaktionsfläche aussieht. In dieser Arbeit wurden die Rolle der Dimerisierung und die mögliche Dimerinteraktionsfläche von Arf1 untersucht. Dazu wurde zum einen die Mutante Arf1Y35F generiert und ihre Eigenschaften im Vergleich zum Arf1 Wildtyp untersucht. Die biochemische Analyse ergab, dass sich Arf1Y35F in den biochemischen Eigenschaften nicht vom Wildtyp-Arf1 unterscheidet, sodass angenommen werden kann, dass der große hydrophobe Rest in die Dimerisierung involviert ist. Zum anderen wurde eine N-terminal verkürzte Arf1-Variante – Arf1NDelta17 – als His-getaggtes Konstrukt in seiner GTP-gebundenen Form chemisch quervernetzt und kristallisiert. Aus der Kristallstruktur, die eine antiparallele Doppelhelix darstellt, ist zu schließen, dass die chemisch quervernetzte Form von His6-Arf1NDelta17 jedoch nicht das aktive Arf1-Dimer darstellt. Da die Orientierung der amphiphilen N-terminalen alpha-Helix mit ihrem Myristoyl-Anker in der Membran möglicherweise eine Rolle für die Dimerisierung spielt, wurde versucht, myristoyliertes Volllängen-Arf1 in der GTP-gebundenen Form in Anwesenheit von Detergentien zu kristallisieren, was jedoch bisher erfolglos blieb. Hierzu konnte der Nukleotidaustausch an Mizellen aus Detergentien anstelle von liposomalen Membranen etabliert werden.

Translation of abstract (English)

Despite extensive biochemical analysis of the formation of COPI coated vesicles, which revealed amongst other things the minimal machinery of COPI-vesicles (the small nuanine nucleotide binding protein (GNBP) Arf1, the coat complex coatomer and proteins of the p24-family) the mechanism of COPI-vesicle biogenesis is yet not fully understood. The small GNBP Arf1 in its GDP-bound form binds to membranes via dimeric p24-proteins (Gommel et al., 2001), where the GEF-mediated nucleotide exchange to GTP occurs. Exchanging GDP to GTP leads to conformational changes in Arf1, resulting in the exposure of its amphiphilic N-terminal alpha-helix with its myristoyl-anchor being inserted into the membrane (Antonny et al., 1997; Franco et al., 1996). Activated membrane-bound Arf1 dimerises, whereas a mutant of Arf1 – Arf1Y35A – is not able to dimerise and fails in generating free COPI vesicles (Beck et al., 2008). However, it is still unknown, at which step dimerisation occurs and how the dimer-interface looks like. The aim of this work was to elucidate the dimer-interface. First, a mutant with an aminoacid mutation in the putative dimer interface – Arf1Y35F – was generated and biochemically analysed. As it behaves like Arf1wt one can speculate that the bulky hydrophobic residue rather than the hydroxyl-group of Y35 is important for dimerisation. Secondly, to get insights into the dimer-interface, an N-terminal truncated version of Arf1 – Arf1NDelta17 – was purified in its GTP-bound form, chemically dimerised and crystallised. Analysis of the crystal structure, which describes an antiparallel double-helix, revealed, that chemically crosslinked Arf1 does not reflect the active Arf1-dimer found on membranes. As the N-terminus might play a role in dimerisation a third approach aimed at crystallising full length Arf1wt in its GTP-bound form in the presence of micelles, which did not succeed so far. The nucleotide exchange of GDP to GTP in Arf1 in the presence of micelles instead of membranes could be established.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Felix
Date of thesis defense: 8. February 2012
Date Deposited: 16. Feb 2012 11:51
Date: 2012
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Arf1 , COPI , Vesikel BiogeneseArf1 , COPI , vesicle biogenesis
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