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Funktionelle Konservierung der Wnt-Liganden in Nematostella vectensis

Ritthaler, Martin

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PDF, German
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Abstract

Die Ausbildung des Blastoporus und die Etablierung eines Organisatorzentrums ist ein entscheidender Moment in der Embryonalentwicklung. Der dafür notwendige Symmetriebruch erfolgt in den meisten rezenten Metazoen durch eine lokale Stabilisierung von beta-Catenin und scheint auch in basalen Stämmen wie Schwämmen und Nesseltieren konserviert. Dies verdeutlicht die enorme Bedeutung des kanonischen Wnt-Signalwegs für die frühe Entwicklung. Die Existenz von Homologen aller aus Bilateriern bekannten Wnt-Gene, mit Ausnahme von Wnt9, in der basalen Seeanemone Nematostella vectensis überrascht. Jedoch legt die Expression der Wnt-Liganden eine Beteiligung an unterschiedlichen Entwicklungsprozessen nahe. Die Identifikation von Komponenten des nicht-kanonischen Wnt/PCP-Signalwegs deutet außerdem darauf hin, dass es bereits in der Evolution der Cnidarier zu einer Trennung von kanonischen und nicht-kanonischen Signalwegen kam. Da sich die Nematostella Wnt-Liganden relativ einfach in die verschiedenen Unterfamilien einteilen lassen, wurde in funktionellen Studien mit heterologen Systemen versucht, die Wnt-Gene dem Wnt/beta-Catenin- oder Wnt/PCP-Signalweg zuzuordnen. Von den hier untersuchten Wnt-Genen lieferte lediglich Wnt1, jedoch nicht das in Bilateriern kanonische Wnt3, einen verlässlichen Hinweis auf die Aktivierung des kanonischen Signalwegs im Achseninduktionsassay in Xenopus laevis und für den TOP-Flash-Reporter im Zellkultursystem. Weitere Ergebnisse zeigen darüber hinaus, dass NvWnt5 und NvWnt11 die konvergente Extension im Frosch beeinflussen, also den nicht-kanonischen Wnt-Signalweg bedienen. Interessanterweise scheint jedoch die genaue Funktion der beiden Gene vertauscht, da NvWnt5 die Depletion von endogenem XlWnt11 retten kann, bzw. NvWnt11 die Depletion von XlWnt5. Der Vergleich der in der Literatur beschriebenen Expressionsmuster mit der hier erstellten Kinetik brachte neue Ergebnisse für die Wnt-Expression. Durch die höhere Sensitivität der RT-PCR-Methode konnten die Transkripte von NvWnt5, -7a, -7b, -8b und -11 bereits maternal nachgewiesen werden. Die weitere Expression aller Wnt-Gene im Blastula-Stadium deutet außerdem auf die Etablierung eines Organisationszentrums durch die Liganden hin, wobei die verschiedenen Wnt-Gene entweder durch redundante Funktionen eine höhere Robustheit des Zentrums gewährleisten oder an einer Feinjustierung beteiligt sind. In weiteren Experimenten wurde schließlich die endogene Funktion von NvWnt3 und -11 untersucht, deren Bilaterier-Homologe sich stereotypisch kanonisch bzw. nicht-kanonisch verhalten. Dabei zeigte die Depletion NvWnt3 durch einen Morpholino keine Effekte auf die frühe Entwicklung, sondern äußerte sich in einer fehlenden Metamorphose zum Primärpolypen. Dadurch verharrten die Tiere in einem „Dauerblastula“-artigem Zustand ohne erkennbare Körperachse, bei dem ungeordnetes Mesenchym unter einer prospektiven Ektodermschicht zu erkennen war. Verantwortlich für diesen Phänotyp scheint die Repression des Forkhead-Transkriptionfaktors zu sein, der in Nematostella die epithelial-mesenchymalen Übergänge reguliert. Da sonstige Wnt-Zielgene in der RT-PCR unbeeinflusst schienen, spricht dies für eine sehr spezifische Rolle von Wnt3 in Nematostella. Die hier beschriebene maternale Expression von NvWnt11 erinnert an die Situation im Frosch, bei der maternales XlWnt11 für die Etablierung der dorso-ventralen Achse benötigt wird. Die Kolokalisation mit anderen Komponenten des Wnt-Signalwegs am zukünftigen oralen Pol in der Blastula deutet eine ähnliche Rolle von Wnt11 an der Achsenspezifizierung in Nematostella an. Die Repression von Wnt-Zielgenen sowie Endoderm-Markern durch den NvWnt11-Morpholino sprechen außerdem für eine überraschende Funktion von Wnt11 im Wnt/beta-Catenin-Signalweg. Die Kompensation sowohl morphologischer als auch genregulatorischer Effekte des Morpholinos durch eine Stabilisation von beta-Catenin mit Alsterpaullone sind ein weiterer Hinweis auf eine Beteiligung von NvWnt11 am kanonischen Signalweg. Da der Morpholino jedoch auch die Depletion des Wnt/PCP-Rezeptors Strabismus phänokopiert, kann von einer dualen Funktion von NvWnt11 sowohl im kanonischen als auch im nicht-kanonischen Weg ausgegangen werden.

Translation of abstract (English)

The formation of the blastopore and the establishment of an organizing center is a crucial event in the development of the embryo. The necessary symmetry break occurs in most extant metazoans by local stabilization of beta-catenin and seems conserved in basal phyla such as sponges and cnidarians. This illustrates the crucial role of the canonical Wnt signalling pathway for early development. The existence of homologs of all known bilaterian Wnt genes, with the exception of Wnt9, in the basal sea anemone Nematostella vectensis was suprising. The identification of components of the non-canonical Wnt/PCP pathway further indicates that the separation of canonical and non-canonical signaling happened during the cnidarian evolution. Since the Nematostella ligands quite easily group into their different Wnt subfamilies, it was tried to assign the Wnt genes to either the Wnt/beta-catenin or the Wnt/PCP pathway using functional studies in heterologous systems. Of all Wnt genes analyzed in this studies only Wnt1, but not Wnt3, was able to relyably activate canonical Wnt signalling in the axis induction assay in Xenopus laevis and for the TOP-Flash reporter in cell culture. Other results further show, that NvWnt5 and NvWnt11 affect convergent extension in frog, thereby act through the non-canonical pathway. However interestingly their exact functions seem to be shifted, as NvWnt5 can rescue the depletion of endogenous XlWnt11, respectively NvWnt11 the depletion of XlWnt5. The comparison of expression patterns described in literature with the kinetics described in this thesis gained new insight for the expression of the Wnt genes. Due to the higher sensitivity of the RT-PCR method transcripts for NvWnt5, -7a, -7b, -8b and -11 could already be detected maternaly. The later expression of all Wnt genes during blastula stage further suggest a role for these ligands in establishing an organizing center where different Wnt genes may provide for a higher robustness of this center or help to fine tune the signal. Additional experiments examined the endogenous function of NvWnt3 and -11, whose bilaterian homologues stereotypically signal through the canonical or the non-canonical pathway respectively. Though the depletion of NvWnt3 by morpholino did not affect early development morphants did not metamorphose to primary polyps. Thus animals remained in a „Dauerblastula“ like state with no apparent body axis showing disorganized mesenchyme covered by prospective ectodermal layer. The repression of the Forkhead transcription factor, that regulates the epithelial-mesenchymal transition in Nematostella, seems to be responsible for this phenotype. Since other Wnt target genes were unaffected in the RT-PCR this points to a very specific role of Wnt3 in Nematostella. The maternal expression of NvWnt11 described here is reminiscent of the situation in frog, where maternal XlWnt11 is needed to establish the dorso-ventral axis. The colocalisation with other components of the Wnt signalling cascade at the future oral pole of the blastula suggests a similar role of Wnt11 for the axis specification in Nematostella. The repression of Wnt target genes and endoderm markers by the NvWnt11 morpholino further are indicative of surprising function of Wnt11 in Wnt/beta-catenin signalling. The compensation of both morphological and gene regulatory effects of the morpholino by a stabilisation of beta-catenin further indicate an involvement of NvWnt11 in canonical signalling. However since the morpholino also phenocopies the depletion of the Wnt/PCP receptor Strabismus one can argue for a dual function of NvWnt11 in both the canonical and non canonical pathway.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Holstein, Prof. Dr. Thomas W.
Date of thesis defense: 23 February 2012
Date Deposited: 15 Mar 2012 09:07
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Wnt , evolution , signalling , cnidaria
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