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Chemotaxis von hämatopoietischen Stammzellen und Leukozyten in Mikrostrukturen

Leinweber, Christina

English Title: Chemotaxis of hematopoietic stem cells and leukocytes in microstructures

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PDF, German
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Abstract

Die hämatopoietischen Stammzellen (HSC) zeigen beispielsweise nach einer Stammzelltransplantation eine chemokingesteuerte Wanderung aus dem Blutkreislauf heraus hin zu ihrem Anknüpfungspunkt im Knochenmark, der hämatopoietischen Stammzellnische. Dieses Verhalten von Zellen, einem Konzentrationsgradienten aktiv nachzufolgen, wird allgemein als Chemotaxis und speziell im Falle der Stammzellwanderung als „homing“ bezeichnet. Neben der Suche nach relevanten Botenstoffsystemen und Einflussfaktoren auf die gerichtete Wanderung der HSC, besteht vor allem bei der Quantifizierung des Migrationsverhaltens und der Sensitivität der HSC noch großer Forschungsbedarf. Selbst für das bereits seit längerem bekannte Botenstoffsystem bestehend aus dem Chemokin Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) und dessen zugehörigen Rezeptor CXCR4 sind der Einfluss von Absolutkonzentration, Gradientensteilheit und Konzentrationsschwellwerten, sowie die Wirkungsweise des CXCR4-Inhibitors AMD3100 noch weitgehend ungeklärt. Das Migrationsverhalten von humanen hämatopoietischen Stammzellen im Bezug auf das SDF-1/CXCR4-Botenstoffsystem wurde daher im Rahmen dieser Arbeit anhand von in vitro-Experimenten näher untersucht. Zur Quantifizierung der HSC-Wanderung wurden zunehmend komplexere Chemotaxis¬experimente angewandt, Microwell-Experimente, ein Transwell-Assay und ein in dieser Arbeit neu entwickelter Mikrofluidikaufbau. Die diffusive Ausbildung der Botenstoffgradienten in diesen Mikrostrukturen wurde mittels Farbstoff- und Partikelexperimenten überprüft und zusätzlich durch numerische Simulationsrechnungen verifiziert. Neutrophile Granulozyten, die den Leukozyten und dem Immunsystem des Körpers zugeordnet werden, sind eine bereits gut erforschte und ebenfalls chemotaktisch migrierende Blutzellspezies. Sie wurden als Modellsystem anstelle der raren und aufwändig zu isolierenden HSC zum Test der Chemotaxisexperimente und vor allem des neuen Mikrostruktursystems eingesetzt. Dabei wurden Möglichkeiten zur Bestimmung der einzelnen Wanderungsparameter ermittelt und die Neutrophilmigration anhand der Mikrofluidikexperimente detailliert untersucht. Für die Untersuchung der Stammzellchemotaxis wurden vorrangig primäre Knochenmarkzellen, die mesenchymalen Stromazellen (MSC), als Modell für die Stammzellnische und als Botenstoffdonoren verwendet. Die Ausschüttung des Chemokins SDF-1 sowie der Einfluss von AMD3100 auf die SDF-1-Sekretion der MSC wurden in dieser Arbeit anhand von ELISA-Tests und Immunofluoreszenzfärbungen ausführlich erforscht. Dadurch wurden eine genaue Definition der diffusionsbasierten Chemokin-gradienten und eine absolute Berechnung der Mindest¬konzentration für die HSC-Migration möglich. Schließlich konnte für die Chemotaxis¬experimente in den Mikrostrukturen ein Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Botenstoffgradienten und der HSC-Wanderung gefunden werden, der zu einer Bestimmung des Schwellwertes für die Sensitivität der HSC gegenüber einem SDF-1-Gradienten führte. Anhand der Korrelation des Wanderungsverhaltens der Neutrophile und HSC mit den durch die Mikrostrukturen definierten Botenstoffgradienten konnte die chemotaktische Zellmigration quantifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen insgesamt, dass durch die Anwendung des entwickelten Mikrofluidikexperimentes neue Erkenntnisse über die Chemotaxis von Blutzellen gewonnen werden können.

Translation of abstract (English)

Hematopoietic stem cells (HSC) are able to migrate out of the blood vessels towards their contact site within the bone marrow, the hematopoietic stem cell niche. This behavior of cells to actively follow a concentration gradient is generally called chemotaxis and particularly in the case of stem cell migration referred to as homing. Besides the search for relevant messenger systems and factors influencing the directed HSC migration still much research for quantification of the HSC chemotaxis and sensitivity of the cells has to be done. Even for the messenger system of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and its corresponding chemokine receptor CXCR4, which is known to be involved in stem cell chemotaxis for already longer time, the influence of absolute concentrations, gradient stiffness and concentration thresholds are yet unclear. Also the effect of the CXCR4 inhibitor AMD3100 on stem cell mobilization and homing is still not completely unraveled. Within this work the migration behavior of human hematopoietic stem cells with regard to the SDF 1/CXCR4 attractant system was investigated by in vitro experiments. To quantify the HSC migration several chemotaxis experiments with increasing complexity were applied, microwell experiments, the Transwell assay and a microfluidic setup, that had been newly developed in this thesis. The diffusional development of the attractant gradient within these microstructures was proven due to experiments with dyes and particles and was additionally verified by numerical simulations. Neutrophil granulocytes are a leukocyte cell species and belong to the immune system. The chemotactic migration of these blood cells is already studied well. HSC are rare and laborious to isolate from cord blood or peripheral blood. Therefore neutrophils were used as a model instead of the HSC for testing of the chemotaxis experiments and especially the new microstructured systems. Thereby possibilities for the determination of the individual migration parameters were ascertained and neutrophil migration was analyzed in detail by applying the microfluidic experiments. For the investigation of the stem cell chemotaxis primary bone marrow cells, the mesenchymal stromal cells (MSC), were used as model of the stem cell niche and as direct donors of the messenger molecules. For the MSCs secretion of the chemokine SDF-1 and the influence of AMD3100 on SDF-1-secretion was studied by the use of ELISA tests and immunofluorescence staining. Thereby the exact definition of diffusional chemokine gradients and the absolute evaluation of the threshold concentrations for the HSC migration became feasible. Finally, a correlation between the development of the attractant gradient and the HSC migration was identified for the chemotaxis experiments in the microstructures, which enabled a threshold determination of the HSC sensitivity concerning the SDF-1 gradient. The chemotactic cell migration could be quantified by the correlation of the migration behavior of neutrophils and HSC with the defined messenger gradients inside the microstructures. Hence, the results of this thesis demonstrate that new insights about the chemotaxis of blood cells can be elucidated by the application of the developed microfluidic experiment.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Grunze, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 24 February 2012
Date Deposited: 22 Mar 2012 15:09
Date: 2012
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: Chemotaxis , Blutstammzellen , Mikrostrukturen , Zellmigrationchemotaxis , blood stem cells , microstructures , cell migration
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