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Virale und zelluläre Faktoren zur Identifizierung HPV-assoziierter Oropharynxkarzinome

Holzinger, Dana

English Title: Viral and cellular factors for the identification of HPV-associated oropharynx carcinomas

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PDF, German
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Abstract

Bestimmte onkogene Typen der humanen Papillomviren (HPV), v. a. der häufigste HPV-Typ 16, sowie potentiell andere weniger prävalente ‚Hochrisiko’-HPV-Typen sind kausal mit einer Untergruppe von Kopf-Hals Tumoren (HNSCC) assoziiert. Unter den HNSCC erscheinen insbesondere die HPV16-positiven Karzinome des Oropharynx (OPSCC) heterogen hinsichtlich der Viruslast, der onkogenen Virus¬aktivität und dem klinischen Verhalten. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurde die Assoziation viraler und zellulärer Marker und der aktiven HPV-Beteiligung beim OPSCC analysiert. Die Analysen beruhten auf den Markern HPV16 DNA, Viruslast, onkogene RNA (E6*II und E6*I Transkripte), virale RNA-Muster und den zellulären Proteinen p16INK4a, pRb, Cyclin D1 and p53. Des Weiteren wurden die Marker in Zusammenhang mit klinischen Parametern und dem Überleben der Patienten ausgewertet, um so diejenigen Marker zu definieren, die das höchste diagnostische und prognostische Potential aufwiesen, Tumoren mit aktiver HPV-Beteiligung zu identifizieren. Zunächst wurden 199 frisch-gefrorene OPSCC auf HPV DNA mittels BSGP5+/6+-PCR/Multiplex HPV Genotypisierung analysiert und anschließend die HPV16 Viruslast mittels HPV16 real-time PCR quantifiziert. Die gespleißten HPV16 Transkripte E6*II und E6*I (226^526) für die Analyse der onkogenen RNA und die Transkripte E1C (880^2582), E1^E4 (880^3358) und L1 (3632^5639) für die Analyse der viralen RNA-Muster wurden durch einen NASBA/Luminex Assay detektiert. Die zellulären Proteine wurden mittels Immun¬histo¬chemie an Gewebechips analysiert, die von 188 Formalin-fixierten und in Paraffin-eingebetteten (FFPE) derselben OPSCC generiert wurden. Die HPV16-Prävalenz (HPV+) betrug insgesamt 49% (97/199). 33/97 (34%) hatten eine hohe (HPVhigh) und 64/97 (66%) OPSCC hatten eine niedrige (HPVlow) Viruslast. Bei 32/33 (97%) HPVhigh und auch bei 16/64 (25%) HPVlow Tumoren waren die onkogenen RNA-Transkripte vorhanden (RNA+). Die viralen RNA-Muster (RNA+/CxCa+) wurden bei 31/33 (94%) HPVhigh und bei 40/48 (83%) RNA+ Tumoren nachgewiesen. Demzufolge lag die Prävalenz von aktivem HPV16 (RNA+/CxCa+) in dieser OPSCC Kohorte bei nur 20% (40/196). Die zellulären Proteinexpressions-Muster der RNA+/CxCa+ OPSCC unterschieden sich signifikant von den HPV— und den RNA— Tumoren. RNA+/CxCa+ war assoziiert mit hohen p16INK4a- und niedrigen pRb-, Cyclin D1- und p53-Expressionsleveln. Nur 31/39 (80%) RNA+/CxCa+, aber auch 23/137 (17%) HPV— oder RNA— Tumoren überexprimierten p16INK4a. Die stärkste Assoziation für RNA+/CxCa+ (OR=59,1; 95%KI=15,3-228,8; p<0,0001) und die besten prädiktiven Werte (Sensitivität 79%, Spezifität 94%, PPV 79%, NPV 94%) wurden für die Kombination von hohen p16INK4a- und niedrigen pRb-Expressionsleveln gefunden. Von allen untersuchten viralen und zellulären Markern oder Markerkombinationen, zeigte RNA+/CxCa+ die höchste Sensitivität und gleichzeitig das geringste Risiko am OPSCC zu versterben (HR=0,31; 95%KI=0,14–0,68; p=0,01) und wurde daher als bester Marker für die Identifizierung der OPSCC mit aktiver HPV-Beteiligung vorgeschlagen. Die klinische Heterogenität unter den HPV16 DNA-positiven OPSCC kann durch die umfangreiche Bestimmung der Viruslast und der Expression der viralen RNA-Muster aufgedeckt werden. Dagegen sollte die Verwendung von zellulären Surrogatmarkern beim OPSCC nicht allein auf der Expression von p16INK4a basieren. Sofern nur FFPE-Material zur Verfügung steht, ist die Markerkombination p16INK4a-hoch/pRb-niedrig, auch in Verbindung mit dem HPV16 DNA-Status, bestens geeignet, einen RNA+/CxCa+ Tumor mit biologisch aktivem HPV16 zu identifizieren, der eindeutig eine eigene OPSCC-Entität mit einem besserem Überleben darstellt.

Translation of abstract (English)

Specific oncogenic types of human papillomaviruses (HPV), most frequently HPV-type 16 and potentially also other less prevalent high-risk HPV types, are causally associated with a subset of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). HNSCC and more specifically oropharyngeal squamous cell carcinomas (OPSCC) containing HPV16 DNA appear heterogeneous regarding viral load, oncogenic activity and clinical behavior. In the present thesis, the association of viral and of cellular markers with transcriptionally active HPV16 in OPSCC was analyzed. Analyses of the markers consisted of HPV16 DNA, viral load, oncogenic RNA (E6*II and E6*I transcripts), viral RNA patterns and cellular proteins p16INK4a, pRb, Cyclin D1 and p53. The markers were further evaluated with clinical parameters and patients’ survival to define the markers with best diagnostic and prognostic significance for the identification of OPSCC with active HPV involvement. 199 fresh-frozen OPSCC were initially analyzed for HPV DNA by BSGP5+/6+-PCR/Multiplex HPV Genotyping and HPV16 DNA was further quantitated by real-time PCR. HPV16 spliced transcripts E6*II and E6*I (226^526) for the analysis of oncogenic RNA and transcripts E1C (880^2582), E1^E4 (880^3358) and L1 (3632^5639) for the analysis of viral RNA patterns were detected by a NASBA/Luminex assay. The expression of the cellular proteins was analyzed by immuno¬histo¬chemistry on tissue microarrays created from 188 formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) OPSCC. Overall, HPV16 prevalence (HPV+) was 49% (97/199). Viral load was high (HPVhigh) in 33/97 (34%) and low (HPVlow) in 64/97 (66%) OPSCCs. Viral oncogene RNA was present (RNA+) in 32/33 (97%) HPVhigh tumors, but also in 16/64 (25%) HPVlow tumors. Viral RNA patterns as seen in cervical carcinomas were present (RNA+/CxCa+) in 31/33 (94%) HPVhigh tumors, and in 40/48 (83%) RNA+ tumors. Thus, prevalence of active HPV16 (RNA+/CxCa+) in this OPSCC cohort was only 20% (40/196). The cellular protein expression profiles of RNA+/CxCa+ OPSCCs were significantly different from both, HPV— and RNA— tumors. RNA+/CxCa+ was associated with high p16INK4a and with low pRb, Cyclin D1 and p53 expression levels. Only 31/39 (80%) RNA+/CxCa+ tumors, but also 23/137 (17%) HPV— or RNA— tumors overexpressed p16INK4a. The strongest associations with RNA+/CxCa+ tumors (OR=59.1, 95%CI=15.3-228.8, p<0.0001) and best predictive values (79% sensitivity, 94% specificity, 79% PPV, 94% NPV) were found for the combination of high p16INK4a and low pRb expression levels. By uni- and multivariate statistical analysis, RNA+/CxCa+ conferred the best sensitivity and also the lowest risk of death from oropharyngeal cancer (HR=0.31, 95%CI=0.14–0.68, p=0.01) of all viral and cellular markers or marker combinations and was therefore suggested to be best marker for the identification of OPSCC with active HPV involvement. Thus, the clinical heterogeneity of HPV16 DNA-positive OPSCC can be overcome by comprehensive determination of viral load and expression of viral RNA patterns. The use of cellular surrogate markers should not rely on expression of p16INK4a alone in head and neck cancer. If only FFPE biopsy material is available, the marker combination p16INK4a-high/pRb-low and also in addition to HPV16 DNA status is best suited to predict and to identify RNA+/CxCa+ OPSCC with biologically active HPV16 which represent a distinct OPSCC entity with improved prognosis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gissmann, Prof. Dr. Lutz
Date of thesis defense: 22. March 2012
Date Deposited: 13. Apr 2012 12:16
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Plattenepithelcarcinom, Humanes Papillomavirus
Uncontrolled Keywords: Oropharynx , virale RNA Muster , E6*II E1^E4 E1C L1 Transkripte , p16 pRb Cyclin D1 p53oropharynx , viral RNA transcription patterns , E6*II E1^E4 E1C L1 transcripts , p16 pRb Cyclin D1 p53
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