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Ceramide Synthase 3 and its Essential Role in Skin Barrier Function and Male Fertility

Rabionet Roig, Mariona

German Title: Ceramid Synthase 3 und ihre essentielle Rolle für die Funktionalität der Hautbarriere und für männliche Fertilität

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Abstract

The functional specialization of sphingolipids (SLs) is determined by their structural diversity and their unique expression patterns according to cell type and degree of differentiation. Ultra long chain (ULC) SLs characterized by an N-acyl moiety longer than 26 carbon atoms in length are primarily expressed in mature male germ cells and epidermal keratinocytes. To unveil the functional role of these unconventional SLs, it is necessary to define their biosynthetic requirements at the molecular level. In mammals, fatty acids are incorporated into SLs at the stage of ceramide synthesis by a family of six homologue enzymes, the ceramide synthases (CerS1–6). By analyzing the expression levels of the CerS family in skin, as well as in juvenile and in “germ cell-free” testis, solely CerS3 mRNA distinctively correlated with the presence of ULC-SLs. As found in vitro, the synthesis of ceramides with cerotoyl- (26:0) and montanoyl-residues (28:0) required CerS3, as demonstrated by a non-radioactive and detergent-free enzymatic assay established in living human cells expressing CerS3. For this purpose, activated ULC-acyl-CoAs as assay substrates and ceramide internal standards for mass spectrometric quantifications were specifically synthesized. The crucial role of CerS3 in the synthesis of ULC-SLs could be further confirmed with CerS3 deficient mice. Mass spectrometric analysis of epidermal extracts established acyl-CoAs ranging from 24 to 36 carbon atoms in length as substrates of CerS3 in vivo. CerS3 deficiency resulted in a complete loss of ceramides with acyl-chains longer than 24 carbon atoms, including all ω-hydroxy-ULC-ceramides. Consequently, the total epidermal ceramides were drastically reduced by 90% leading to a severe impairment of the epidermal permeability barrier and ultimately to premature neonatal death. The metabolic defect of CerS3 mice gave rise to a multitude of alterations associated with the maturation and terminal cornification of keratinocytes. At the stratum granulosum (SG), diminished size in filaggrin-containing granules and reduced number of loricrin-containing granules were accompanied by aberrant processing of filaggrin and decreased levels of loricrin. At the stratum corneum (SC), remnants of glycogen, nuclear material and organelle structures were detected at the first corneocyte layers. CerS3d/d mice exhibited a markedly thickened and compact SC that could be associated with the persistence of corneodesmosomes, eventually resulting from the reduced expression of the protease cathepsin D at the SG and SC. Additionally, the defective degradation of corneodesmosomes led to the distinctive persistence of the embryonic peridermal layer in newborn mutant epidermis. Furthermore, CerS3 deficient mice exhibited disorganized lamellar sheets that yield the formation of non-lamellar lipid agglomerates, rather than building up evenly distributed lipid unit lamellar structures. The compromised skin integrity of mutant mice facilitated the severe invasion of pathogens evidenced by the increased microbial growth and the formation of pseudohyphae prior to colonization by Candida albicans on cultured skin biopsies. In summary, these results demonstrated the prerequisite of a functional CerS3 for the generation of ULC-SLs, which play an essential role in skin barrier function and male fertility. The phenotypic alterations derived from the in vivo depletion of CerS3 suggested in addition a crucial regulatory function that could be encoded within the homeobox domain. Taken all together, these findings established the basis for the identification and diagnosis of potential human skin disorders associated with a CerS3 dysfunction.

Translation of abstract (German)

Die funktionelle Spezialisierung von Sphingolipiden (SL) wird durch ihre strukturelle Vielfalt und durch die spezifischen Expressionsmuster in Abhängigkeit von Zelltyp und Grad der Differenzierung festgelegt. Ultra-langkettige ("Ultra Long Chain", ULC) SL, die sich durch einen N-Acylsubstituenten mit einer Kettenlänge vom mehr als 26 C-Atomen auszeichnen, werden primär in reifen männlichen Keimzellen und Keratinozyten der Epidermis exprimiert. Um die funktionelle Rolle dieser ungewöhnlichen SL zu verstehen, ist es notwendig, zuerst ihre Biosynthese auf einer molekularen Basis zu begreifen. Bei Säugetieren werden Fettsäuren von einer Familie von 6 homologen Genen, den sog. Ceramidsynthasen (CerS1–6), während der Ceramidsynthese in SL eingebaut. Mit der Bestimmung der Expressionslevel dieser CerS-Familie in der Haut, sowie im juvenilen und „keimzellenfreien“ Hoden konnte einzig die CerS3-mRNS mit dem Vorkommen der ULC-SL korreliert werden. Die In vitro-Synthese von Ceramiden mit Cerotin- (26:0) oder Montansäureresten (28:0) setzt die CerS3-Aktivität voraus. Dies konnte anhand eines erstmalig etablierten, nicht-radioaktiven und detergenzfreien, enzymatischen Tests, basierend auf vitalen humanen Zellen die CerS3 exprimieren, nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck wurden ULC-acyl-CoA als Substrate sowie Ceramide mit verkürzter Sphingoidbase speziell synthetisiert, und die letzteren als interne Standards für massenspektrometrische Quantifizierung eingesetzt. Die bedeutende Rolle von CerS3 bei der Synthese von ULC-SL konnte durch Untersuchungen an CerS3-defizienten Mäusen weiter untermauert werden. Differenzielle massenspektrometrische Untersuchungen wiesen Acyl-CoA mit einer Kettenlänge von 24 bis 36 Kohlenstoffen als Substrate von CerS3 in vivo aus. CerS3-Defizienz führte zu einem kompletten Verlust der Ceramide mit einer Kettenlänge von mehr als 24 Kohlenstoffatomen, einschließlich aller ω-Hydroxy-ULC-Ceramide. Die Gesamtzahl aller Ceramide der Epidermis war um 90% reduziert, was zu einer starken Beeinträchtigung der Wasserpermeabilitätsschranke der Epidermis und letztlich zu einem vorzeitigen neonatalen Tod führte. Der metabolische Defekt der CerS3-Mutanten äußerte sich in einer Vielzahl von phänotypischen Veränderungen in Reifung und terminaler Verhornung der Keratinozyten. Im Stratum granulosum (SG) wurde eine Reduktion in der Größe der Filaggringranula als auch der Loricringranula beobachtet, begleitet von einer fehlerhaften Prozessierung des Filaggrins und einem Abfall des Loricringehaltes im SG. In den ersten Korneozytenschichten des Stratum corneum (SG) konnten Reste von Gykogen, Zellkernmaterial und Organellen nachgewiesen werden. CerS3d/d-Mäuse zeigten ein deutlich verdicktes und kompaktes SC. Ursache hierfür ist wohl die Persistenz von Corneodesmosomen, bedingt u.a. durch eine niedrige Konzentration der Protease Cathepsin D im SG und SC. Weiterhin führte der defiziente Abbau von Corneodesmosomen zum Erhalt des Periderms auf der Haut von neugeborenen Knockout-Tieren. Zusätzlich wiesen CerS3-defiziente Mäuse ungeordnete lamelläre Lipidschichten auf, die zur Bildung von nichtlamellaren Lipidagglomeraten führten und nicht zu den gleichmäßig gespreiteten, lamellär strukturierten Lipideinheiten zwischen den Corneozyten. Die in ihrer Funktion kompromittierte Haut der Mutanten erleichterte in Biopsiekulturen erhöhtes mikrobiologisches Wachstum von Pathogenen/ Candida albicans, die Bildung von invasiven Pseudohyphen und anschließende Kolonisierung in tiefere Schichten. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse die Notwendigkeit einer intakten CerS3 für die Bildung von ULC-SL, die eine essentielle Rolle in der Funktion der Hautbarriere und bei der männlichen Fortpflanzung spielen. Die phänotypischen Veränderungen, die durch Abwesenheit intakter CerS3 in vivo hervorgerufen werden, deuten auf eine zusätzliche regulatorische Funktion dieses Proteins hin, die innerhalb der Homeobox-Domäne kodiert sein könnte. Die vorliegenden Resultate sind Grundlage für die Identifikation und Diagnose potentieller menschlicher Hauterkrankungen, die auf einer CerS3 Fehlfunktion beruhen könnten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Nickel, Prof. Dr. Walter
Date of thesis defense: 14 February 2011
Date Deposited: 14 May 2012 07:38
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Sphingolipide, Ceramide, Haut, Hoden, Fertilität, Massenspektrometrie
Uncontrolled Keywords: Ultra long chain (ULC) sphingolipids , Ceramide synthase 3 , Lass3
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