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RNA functionalization strategies and their application to RNA folding dynamics and experimental RNomics

Samanta, Ayan

German Title: RNA Funktionalisierungsstrategien und deren Anwendung auf RNA Faltungsdynamik und experimentelle RNomics

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Abstract

The oversimplified notion of RNA being a mere carrier of sequence information from gene to protein has been repeatedly undermined over the decades by yet another newly discovered function performed by certain RNA species. These new species include in particular RNAs which regulate gene expression in response to a metabolite sensing event. These RNAs — known as riboswitches — elegantly couple metabolite recognition with gene regulation in the apparent absence of protein helpers. Here we first sought to investigate the folding dynamics of the S-adenosyl-L-methionine responsive riboswitch by FRET spectroscopy. This requires the synthesis of full-length riboswitch constructs site-specifically modified with multiple fluorophores. For this challenging task we have established a 5-way splinted-ligation strategy to prepare dual-fluorophore labelled full-length riboswitch constructs in an unprecedented overall yield of 10 %. These constructs have further been subjected to bulk and single molecule FRET spectroscopy for ligand induced folding analysis. We confirmed similar folding dynamics for the aptamer of the complete riboswitch (aptamer + expression platform) as reported earlier for constructs containing the aptamer alone. However, we also observed a few other folding phenomena induced by a chemically slightly different, yet non-cognate metabolite, which cannot be explained by any facts known about this riboswitch to date and require further experiments to reach a final conclusion. During the course of the aforesaid work, we realized the limitations of existing nucleic acid functionalization strategies. Therefore we decided to use bioorthogonal click reactions as part of our labelling strategy. Among various different click reactions, we first had to find the one which best suits our purpose and to optimize its conditions. Having the optimized click reaction conditions at hand, we developed enzymatic strategies to site-specifically functionalize long RNAs with clickable residues. In our nucleic acid labelling strategy a diverse array of different chemical functionalities can be introduced exploiting the modular nature of click chemistry. This does not demand either de novo synthesis or optimizations of enzymatic reaction conditions for each new single compound. Furthermore, we developed a chemical approach using two different mutually orthogonal click reactions for concurrent, site-specific labelling of DNA molecules with multiple fluorophores. Moreover, we sought to extend this strategy of enzymatic, site-specific transfer of clickable residues to long RNAs towards photochemical transfer of clickable moieties to a target RNA in a mixture of many unrelated sequences. This technique, which we call Affinity-based Chemical RNomics is a chemical approach in experimental RNomics whereby RNA sequences which bind to a given small-molecule metabolite are to be isolated from a total RNA isolate of any organism just by the virtue of its tight binding to its cognate metabolite and without any prior knowledge of its sequence. This method would therefore allow for the discovery of previously unknown riboswitches, currently the only known kind of natural RNA that binds small-molecule metabolites. Since all currently known riboswitches have been discovered by rational approaches, this will considerably extend the chances of discovering new riboswitches.

Translation of abstract (German)

Die übervereinfachte Vorstellung, dass RNA lediglich als Träger von Protein-Sequenzinformation dient, wurde über die Jahrzehnte immer wieder durch neu entdeckte Funktionen, die bestimmte RNA-Spezies ausüben können, untergraben. Diese neuen Spezies beinhalten insbesondere RNAs, die Genexpression als Reaktion auf einen Metaboliten-Stimulus regulieren. Diese RNAs – bekannt unter dem Namen Riboswitches, wörtlich Ribo-Schalter – koppeln auf elegante Weise Metaboliten-Erkennung an Genregulation, ohne dafür Proteine zu benötigen. In dieser Arbeit wollten wir zunächst die Faltungs-Dynamik des S-Adenosyl-L-Methionin-Riboswitches mittels FRET-Spektroskopie untersuchen. Dazu war die Synthese von Volllängen-Riboswitch-Konstrukten nötig, welche ortsspezifisch mit Fluorophoren modifiziert waren. Um dies zu bewerkstelligen, etablierten wir eine Strategie, bei der mittels eines “Splints” fünf Fragmente mit einer noch nie erreichten Effizienz von 10% ligiert wurden. Die doppelt farbstoffmarkierten Konstrukte wurden danach mittels „Bulk“- und Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie auf ligandeninduzierte Faltung hin untersucht. So konnten wir für das Aptamer des gesamten Riboswitches (Aptamer + Expressionsplattform) ähnliche Faltungsdynamiken bestätigen, wie sie bereits für Konstrukte, die nur das Aptamer enthielten publiziert worden waren. Dennoch beobachteten wir auch einige andere Faltungs-Phänomene, welche durch einen chemisch nur wenig abweichenden, jedoch eigentlich Riboswitch-fremden Metaboliten induziert wurden, die durch keine der bisher über diesen Riboswitch bekannten Fakten erklärt werden können und weitere Experimente zur endgültigen Klärung benötigen. Während der zuvor beschriebenen Arbeit bemerkten wir die Einschränkungen der bestehenden Nukleinsäure-Funktionalisierungsstrategien. Daher entschlossen wir uns, bioorthogonale Click-Reaktionen als Teil unserer Funktionalisierungsstrategie zu verwenden. Unter den verschiedenen Click-Reaktionen mussten wir zunächst diejenige identifizieren, die für unsere Zwecke am besten geeignet ist, und dann deren Reaktionsbedingungen optimieren. Danach entwickelten wir enzymatische Strategien um lange RNA-Moleküle mit „clickbaren” Resten zu versehen. Mit unserer Nukleinsäure-Markierungsstrategie kann unter Ausnutzung der modularen Natur der Click-Chemie eine Reihe verschiedener funktionaler Gruppen eingeführt werden. Dazu sind weder de novo Synthese noch Optimierung enzymatischer Reaktionsbedingungen für jede neue Verbindung vonnöten. Weiterhin entwickelten wir eine chemische Methode zur gleichzeitigen, ortsspezifischen Doppelmarkierung von DNA-Molekülen mit multiplen Fluorophoren unter Benutzung zweier wechselseitig orthogonaler Click-Reaktionen. Desweiteren versuchten wir, die Strategie des enzymatischen, ortsspezifischen Transfers „clickbarer“ Reste auf lange RNAs auf den photochemischen Transfer ebensolcher Gruppen auf eine Ziel-RNA in einer Mischung von vielen nicht-verwandten Sequenzen auszuweiten. Diese Technik, die wir als „affinitätsbasierte chemische RNomik” bezeichnen, ist eine chemische Methode in der experimentellen RNomik. Durch diese sollen RNA-Sequenzen, die an einen gegebenen niedermolekularen Metaboliten binden, ausschließlich aufgrund ihrer festen Bindung an diesen Metaboliten und ohne Vorwissen bezüglich ihrer Sequenz aus einem Total-RNA-Isolat eines beliebigen Organismus’ isoliert werden. Diese Methode sollte es daher ermöglichen, zuvor unbekannte Riboswitches zu entdecken – die bisher einzige bekannte Sorte natürlich vorkommender RNAs, die niedermolekulare Metaboliten bindet. Da alle bisher bekannten Riboswitches über rationale Ansätze entdeckt wurden, wird dies die Möglichkeiten zur Entdeckung neuer Riboswitches deutlich erweitern.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Dr. Andres
Date of thesis defense: 15. May 2012
Date Deposited: 04. Jun 2012 08:21
Date: 2012
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: RNA functionalization , experimental RNomics
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