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Theoretische Modellierung aktiver Zentren von molybdänabhängigen Enzymen

Habib, Uzma

English Title: Molecular modelling on active sites of molybdenum dependent enzymes

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Abstract

Molybdenum and tungsten active site model complexes, derived from the protein X-ray crystal structure of the first W-containing nitrate reductase isolated from Pyrobaculum aerophilum, were computed for nitrate reduction at the COSMOB3LYP/SDDp//B3LYP/Lanl2DZ(p) level of density functional theory (DFT). The molybdenum containing active site model complex has a considerably larger activation energy (34.4 kcal/mol) for the oxygen atom transfer from the nitrate to the metal center as compared to the tungsten containing active site model complex (12.0 kcal/mol). Oxidation of the educt complex is close to thermoneutral (-1.9 kcal/mol) for the Mo active site model complex but strongly exothermic (-34.7 kcal/mol) for the W containing active site model complex. The low relative energy for the oxidized W metal complex makes the regeneration of the +IV oxidation state much more difficult as compared to the Mo metal complex. The MVI to MIV reduction requires much more reductive power (more negative redox potential)when the metal center M is a tungsten rather than a molybdenum atom. So, although the reduction of nitrate is stimulated when W replaces Mo in the active site of Nar the catalytic cycle breaks after the reduction of nitrate to nitrite when the biochemical reducer is not strong enough to reduce the metal center. Ethylbenzene dehydrogenase (EBDH) is an enzyme that catalyzes the oxygen-independent, stereospecific hydroxylation of ethylbenzene to (S)-1-phenylethanol. EBDH active site models, derived from protein X-ray crystal structure, were computed at the COSMOB3LYP/SDDp//B3LYP/Lanl2DZ(p) energy level of DFT in order to investigate most probable mechanism, ionic or radical pathway. In addition, different protonation states and participation of amino acid residues near to the Mo center were considered. Models with protonation of His192, Lys450, Asp223 and model without protonation were investigated for comparison. Computed relative energies indicate that the overall lowest energy barrier pathway results when ionic and radical pathways are mixed. This mechanism of ethylbenzene hydroxylation starts with a homolytic C1-Hs bond cleavage (TS1’) resulting in the formation of a radical type intermediate (I’) and then in order to continue the reaction by the easier O1Hs anion transfer, an electron needs to be transferred from the substrate to the Mo-OH moiety to transform the di-radical to the zwitter ionic intermediate. Then the transfer of O1Hs anion from the Mo to the cationic substrate (TS2) results in the formation of product bound complex (P). Among those the protonated Lys site corresponds to the energetically best pathway for the hydroxylation of ethylbenzene by EBDH. Acetylene hydratase (AH) of Pelobacter acetylenicus is a tungsten (W) containing iron-sulfur enzyme that catalyzes the transformation of acetylene to acetaldehyde. DFT studies were performed on the model complexes derived from the native protein X-ray crystal structure of AH. Based on the computational results we proposed the most likely nucleophilic mechanism for the hydration of acetylene by the acetylene hydratase (AH) enzyme. In this mechanism, the water (Wat1424) molecule is coordinated to the W center and Asp13 is assumed to be in anionic form. The Wat1424 molecule is activated by W and then donates one of its proton to the anionic Asp13 forming the W-bound hydroxide and protonated Asp13. The W-bound hydroxide then attacks the C1 atom of acetylene together with the transfer of proton from the Asp13 to its C2 atom, resulting in the formation of a vinyl alcohol intermediate complex. The energy barrier associated with this step is 14.4 kcal/mol. The final, rate limiting, step corresponds to the tautomerization of the vinyl alcohol intermediate to acetaldehyde via intermolecular assistance of two water molecules, associated with the energy barrier of 18.9 kcal/mol. An alternative, electrophilc pathway, was also considered but the energy barriers are found to be higher than for the nucleophilic pathway described here. Sulfite oxidase (SO), selenate reductase (SeR) and nitrate reductases (NRs) are among the mononuclear molybdenum enzymes involved in the catalysis of metabolic redox reactions.The active site composition of SO has one molybdopterin (MPT) ligand and it oxidizes the sulfite to sulfate, SeR has two MPT ligands and it reduces the selenate to selenite, while NRs reduces nitrate to nitrite by either one or with two MPT’s at the active site. Is the active site itself special in some way for the oxidation/reduction of one or the other substrate? Or do the different active sites behave essentially the same way and it is the role of the protein to make it specific. To clarify these, DFT studies were performed on the computational model complex, [MoVIO2(S2C2Me2)SMe]- (A, derived from the X-ray crystal structure of native SO),and on the experimental model complex [MoVIO2(mnt)2]2- (B, coordination mode similar to the active site of SeR) for the oxidation of selenite and sulfite. For the oxidation of sulfite model A which resembles the SO active site is clearly the best choice (lowest barrier, minor exothermicity). For the reduction of selenate a smaller activation is computed for model A, but the reaction is less exothermic with model B, which resembles the SeR active site. DFT computations were also carried out on simple active site model complexes of SeR to investigate different ways of binding the substrate and the OAT reaction. Unfortunately, the results are little conclusive. Larger models might be needed to obtain more meaningful computational results.

Translation of abstract (German)

Ausgehend von der Protein-Röntgenbeugungs-Kristallstruktur der ersten wolframhaltigen Nitratreduktase, die aus Pyrobaculum aerophilum isoliert wurde, wurden molybdän- und wolframhaltige Modellkomplexe für das aktive Zentrum auf dem COSMO-B3LYP/SDDp//B3LYP/Lanl2DZ(p) Dichtefunktionaltheorie(DFT)-Niveau hinsichtlich der Reduktion von Nitrat berechnet. Der Mo-haltige Modellkomplex besitzt eine wesentlich größere Aktivierungsenergie (34.4 kcal/mol) für den Sauerstoffatomtransfer (OAT) von Nitrat auf das Metallzentrum als das W-Analogon (12.0 kcal/mol). Die Oxidation des Eduktkomplexes ist nahezu thermoneutral (-1.9 kcal/mol) für den molybdänhaltigen Modellkomplexes, aber deutlich exotherm (-34.7 kcal/mol) im Falle des Wolframkomplexes. Die vergleichsweise niedrige relative Energie des oxidierten Wolframkomplexes erschwert die Regeneration der Oxidationsstufe +IV deutlich im Vergleich zum Molybdänkomplex. Die Reduktion von MVI zu MIV erfordert also eine höhere Reduktionskraft (negativeres Redoxpotenzial), wenn das Metallzentrum M aus einem Wolfram- statt einem Molybdänatom besteht. Obwohl die Reduktion von Nitrat gefördert wird, wenn W das Mo im aktiven Zentrum ersetzt, wird der katalytische Zyklus nach der ersten Reduktion eines Nitrations unterbrochen, wenn das biochemische Reduktionsmittel nicht stark genug ist, das Metallzentrum zu reduzieren. Das Enzym Ethylbenzoldehydrogenase (EBDH) katalysiert die sauerstoffunabhängige stereospezifische Hydroxylierung von Ethylbenzol zu (S)-1-Phenylethanol. Modellkomplexe für das aktive Zentrum von EBDH, abgeleitet aus der Protein-Röntgenbeugungs-Kristallstruktur, wurden mit dem COSMO-B3LYP/SDDp//B3LYP/Lanl2DZ(p) DFT-Niveau berechnet um den wahrscheinlichsten Mechanismus aufzufinden. Sowohl ionische als auch radikalische Reaktionspfade wurden in Betracht gezogen und zwar für verschiedene Protonierungszustände von Aminosäureresten, die wegen ihrer räumlichen Nähe zum Molybdänzentrum an der Reaktion teilhaben könnten. Modelle mit protonierten Aminosäureresten von His192, Lys450 und Asp223 sowie ein Modell ohne Protonierung wurden vergleichend untersucht. Die berechneten relativen Energien weisen darauf hin, dass der Reaktionspfad mit den insgesamt geringsten Barrieren aus einer Mischung von ionischen und radikalischen Reaktionsschritten resultiert. Dabei wird die Hydroxylierung von Ethylbenzol durch einen homolytischen C1-Hs Bindungsbruch (TS1‘) eingeleitet, was zu einem diradikalischen Intermediat (I‘) führt. Um dann den leichteren Transfer eines OH Anions zu ermöglichen, müsste zunächst ein Elektron vom Substrat auf die Mo-OH Einheit übertragen werden, was aus dem diradikalischen das zwitterionische Intermediat werden lässt. Die Übertragung des O1Hs Anions vom Molybdän auf das kationische Substrat (TS2) lässt den Produktkomplex (P) entstehen. Der energetisch günstigste Reaktionspfad für die Hydroxylierung von Ethylbenzol durch EBDH ergibt sich dabei für die protonierte Lysinseitenkette. Acetylenhydratase (AH) aus Pelobacter acetylenicus ist ein wolframhaltiges Eisen-Schwefel-Enzym, das die Umsetzung von Acetylen zu Acetaldehyd katalysiert. Modellkomplexe, die aus der nativen AH-Proteinkristallstruktur abgeleitet wurden, wurden mit DFT-Methoden untersucht. Basierend auf den Rechenergebnissen wird ein nukleophiler Mechanismus als der wahrscheinlichste für die Hydratisierung von Acetylen durch AH vorgeschlagen. Gemäß diesem Mechanismus ist ein Wassermolekül (Wat1424) an das W-Zentrum koordiniert und Asp13 wird als ionisiert angenommen. Das Wassermolekül Wat1424 ist durch das W aktiviert und gibt so ein Proton an die anionische Gruppe Asp13 ab, was zu einem W-gebundenen Hydroxid und protoniertem Asp13 führt. Das W-gebundene Hydroxid greift das C1-Atom des Acetylens an und damit gekoppelt erfolgt der Protonentransfer von Asp13 auf das C2-Atom. Dadurch bildet sich ein intermediärer Vinylalkohol-Komplex. Die Energiebarriere für diesen Schritt beträgt 14.4 kcal/mol. Den abschließenden, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt stellt die Tautomerisierung des Vinylalkohols zu Acetaldehyd dar. Dafür wird unter Einbeziehung von zwei Wassermolekülen eine Barriere von 18.9 kcal/mol berechnet. Für einen alternativen, elektrophilen Reaktionspfad wurden höhere Barrieren als für den hier beschriebenen nukleophilen berechnet. Sulfit Oxidase (SO), Selenat Reduktase (SeR) und Nitrat Reduktasen (NRs) gehören zu den mononuklearen Molybdoenzymen, die metabolische Redoxreaktionen katalysieren. Das SO aktive Zentrum besitzt einen Molybdopterinliganden (MPT) und oxidiert Sulfit zu Sulfat; SeR mit zwei MPT reduziert Selenat zu Selenit; NRs schließlich können Nitrat zu Nitrit reduzieren und besitzen entweder einen oder zweit MPT-Liganden im aktiven Zentrum. Ist das aktive Zentrum in irgendeiner Art spezifisch für die Oxidation bzw. die Reduktion des einen oder anderen Substrates? Oder verhalten sich die verschiedenartigen Aktiven Zentren im Wesentlichen gleich und erst das Protein schafft Spezifität? Zur Klärung dieser Fragen wurde die Selenit- und die Sulfitoxidation durch Modellkomplexe mit DFT rechnerisch untersucht: [MoVIO2(S2C2Me2)SMe]- (A, abgeleitet von der Röntgenkristallstruktur der nativen SO) und der auch experimentell untersuchte Modellkomplex [MoIVO(mnt)2]2- (B, mit einem der SeR ähnlichen Koordinationsmuster). Für die Oxidation von Sulfit stellt Modell A tatsächlich die beste Wahl dar (geringste Barriere, geringfügig exotherme Reaktionsenergie).Für die Reduktion von Selenat hingegen wird zwar mit Modell A eine geringere Barriere berechnet, aber die Reaktion verläuft mit Modell B weniger stark exotherm. Weitere DFT Rechnungen wurden an einfachen Modellkomplexen zum aktiven Zentrum der SeR unternommen, um verschiedene Bindungsmodi des Substrats und die Sauerstoffübertragung zu untersuchen. Die Ergebnisse sind leider wenig aufschlussreich. Größere Modelle dürften nötig sein um sinnvollere Rechenergebnisse zu erhalten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hofmann, Dr. PD Matthias
Date of thesis defense: 25 May 2012
Date Deposited: 04 Jun 2012 15:06
Date: 2012
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Theoretische Modellierung, molybdänabhängigen Enzymen
Uncontrolled Keywords: Theoretische Modellierung , molybdänabhängigen EnzymenMolecular modelling , molybdenum dependent enzyme
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