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Calcium signaling in fish cells

Schweizer, Nadja

German Title: Calciumsignale in Fischzellen

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Abstract

One basic cellular response towards a multitude of physical and chemical factors is the modulation of intracellular Ca2+ levels. There is also considerable evidence that a number of toxicants have an impact on Ca2+ signaling processes, alter them, and may induce cell death. Given the immense versatility of Ca2+ modulation due to the complex mechanisms which help to encode information, recording of the intracellular Ca2+ signal might eventually be a useful tool for the detection and identification of environmental stressors. Notwithstanding the universal character of Ca2+ signaling and the highly conserved pathways, research on Ca2+ as a second messenger has mainly been restricted to mammalian models. Much less is known about its function and mode of action in fish and only a handful of papers deal with the question whether there is a Ca2+ response to environmental toxicants or not. The present thesis aims at closing some of the remaining gaps. Therefore, after adapting the cell culture and Ca2+ imaging protocols for the needs of this study, the reaction of intracellular Ca2+ to different “classical” agonists such as phenylephrine and ATP was investigated systematically in order to find out the basic principles of Ca2+ dynamics in teleost fish cells. Two cell types were used and compared to one another: primary hepatocytes from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), and the permanent fish cell line RTL-W1 derived from rainbow trout liver, both established model systems in aquatic ecotoxicology. From an ecotoxicological point of view, we tried to answer the question whether Ca2+ imaging can be applied for the early detection of environmental stress with cell death as a last consequence. Therefore, selected model environmental toxicants and stressors such as 4-nitrophenol, 3,4-dichloroaniline, and hydrogen peroxide were used to elucidate possible interactions between contaminants and Ca2+ signaling in RTL-W1 cells. Ca2+ oscillations in response to several stimuli were recorded in RTL-W1 cells and to a lesser extent in primary hepatocytes. Interestingly, these Ca2+ oscillations are amplitude-encoded in contrast to their mammalian counterpart. Moreover, Ca2+ release in rat cells during oscillations is markedly faster than the uptake, whereas this relation is more symmetric in the fish cells. Bioinformatics and computational analysis were employed to identify key players of Ca2+ signaling in fish and to determine likely causes for the experimentally observed differences between the Ca2+ dynamics in fish cells compared to those in mammalian liver cells. Different binding characteristics of the IP3R, e.g. responsible for the Ca2+-induced Ca2+ release, could be the origin of the observations. The present thesis also indicates that the fish cell line RTL-W1 is a suitable tool for the investigation of Ca2+ signals in consequence of toxicant exposure. Evidence is provided that ecotoxicologically relevant substances take influence on intracellular Ca2+. Namely hydrogen peroxide and 4-nitrophenol showed a clear response and produced marked Ca2+ oscillations at sublethal concentrations. Effect intensity and threshold varied from cell to cell; however, general effects were reproducible and dose-dependent. At concentrations below those inducing elevated cytotoxicity and apoptosis rates (assessed by the neutral red assay and the apoptosis assay with Hoechst 33342), there is a lasting, unspecific increase in the intracellular Ca2+ level which might be interpreted as a precursor of apoptotic or necrotic processes in the cell. Generally, Ca2+ signals seem to be dependent on the pathway activated or non-specifically interfered by the respective substance. The question whether specific types of Ca2+ responses are specific of and may be used to characterize different types of stressors still cannot be answered at present. However, there is evidence that Ca2+ imaging might provide a highly sensitive, yet non-specific indicator of toxic impact, since, as a second messenger, intracellular Ca2+ integrates toxic effects of multiple other sublethal parameters.

Translation of abstract (German)

Die Modellierung des intrazellulären Ca2+-Spiegels ist eine grundlegende zelluläre Reaktion auf eine Vielzahl physikalischer und chemischer Faktoren. Es deutet vieles darauf hin, dass toxische Substanzen einen Einfluss auf Ca2+-Signalwege ausüben, sie modifizieren und den Zelltod einleiten können. Die Ca2+-Modulierung zeichnet sich durch große Variabilität aus, welche durch die komplexen Mechanismen ermöglicht wird, die zur Codierung der Information beitragen. Möglicherweise könnte sie daher als Werkzeug zur Identifizierung von Umweltstressoren dienen. Ungeachtet der Universalität von Ca2+ als sekundärem Botenstoff und der stark konservierten Signalwege beschränkt sich die Ca2+-Forschung bisher weitgehend auf Säugermodelle. Über die Funktionen und Wirkmechanismen in Fischzellen ist wenig bekannt, und die Frage nach einer Ca2+-Antwort auf Umweltchemikalien wird nur in wenigen Studien behandelt. Die vorliegende Arbeit soll einige dieser Lücken schließen. Nach der Anpassung und Optimierung der Zellkulturbedingungen und Ca2+-Imaging-Protokolle wurde daher die Reaktion des intrazellulären Ca2+-Spiegels auf verschiedene „klassische“ Agonisten wie Phenylephrin und ATP untersucht, um die grundlegenden Prinzipien der Ca2+-Modellierung in Fischzellen zu erkennen. Zwei Zelltypen und etablierte Modellsysteme der aquatischen Ökotoxikologie wurden miteinander verglichen: Primärhepatocyten der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) sowie die permanente Fischzelllinie RTL-W1 aus der Leber der Regenbogenforelle. Aus ökotoxikologischer Sicht sollte ferner die Frage beantwortet werden, ob Ca2+-Messungen zur frühzeitigen Erkennung von Umweltstress – mit dem Zelltod als letzter Konsequenz – eingesetzt werden können. In RTL-W1-Zellen wurden daher ausgewählte Umweltchemikalien wie 4-Nitrophenol, 3,4-DCA und Wasserstoffperoxid untersucht, um mögliche Interaktionen zwischen Schadstoffen und Ca2+-Signal aufzudecken. Es konnten Oszillationen des Ca2+-Spiegels als Reaktion auf verschiedene Stimuli sowohl in RTL-W1-Zellen als auch (in geringerem Maße) in Primärhepatocyten nachgewiesen werden. Bemerkens-werterweise sind diese im Gegensatz zu Ca2+-Oszillationen in Säugerzellen amplitudencodiert. Darüber hinaus ist das Verhältnis Anstieg/Abfall des Ca2+-Gehalts während der Oszillation in Fischzellen symmetrischer als in Säugerzellen. Mit Hilfe von Bioinformatik und Computeranalysen sollten die Hauptkomponenten der Ca2+-Signalwege in Fischzellen identifiziert und mögliche Ursachen für die experimentell beobachteten Unterschiede zwischen Fisch- und Säugerzellen erkannt werden. Unterschiedliche Bindungseigenschaften des IP3-Rezeptors, verantwortlich beispielsweise für den CICR (Ca2+-induced Ca2+ release, Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung), könnten demnach die Ursache der Beobachtungen sein. Die vorliegende Studie zeigt auch, dass die Fischzelllinie RTL-W1 ein gutes Mittel zur Untersuchung von Veränderungen des Ca2+-Spiegels in Folge toxischer Exposition ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass ökotoxikologisch relevante Substanzen intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen beeinflussen. Insbesondere Wasserstoffperoxid und 4-Nitrophenol zeigten eine klare Wirkung und riefen deutliche Oszillationen in subletalen Konzentrationen hervor. Effektintensität und Wirkschwelle variierten von Zelle zu Zelle; die allgemeinen Effekte waren jedoch reproduzierbar und konzentrationsabhängig. Konzentrationen, welche noch keine erhöhte Cytotoxizität und Apoptoseraten hervorriefen, bewirkten einen anhaltenden unspezifischen Anstieg des intrazellulären Ca2+-Gehalts, der als Vorbote apoptotischer oder nekrotischer Prozesse in der Zelle gedeutet werden kann. Generell scheinen Ca2+-Signale von dem Signalweg abzuhängen, welcher durch die jeweilige Substanz aktiviert oder in welchen unspezifisch eingegriffen wird. Die Frage, ob bestimmte Ca2+-Signaltypen spezifisch für bestimmte Stressortypen sind und zu deren Charakterisierung genutzt werden können, kann zum gegenwärtigen Stand der Forschung nicht beantwortet werden. Dennoch könnten Untersuchungen des zellulären Ca2+-Spiegels als sehr sensitiver, wenn auch unspezifischer, Indikator toxischer Belastung dienen, da dieser als sekundärer Botenstoff die Effekte vieler weiterer subletaler Parameter integriert.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Braunbeck, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 22 December 2011
Date Deposited: 06 Jun 2012 07:54
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Calcium, Regenbogenforelle, Zelllinie, Umwelttoxikologie, Primärelement, Leber
Uncontrolled Keywords: Calciumoszillation , RTL-W1calcium oscillation , cell line RTL-W1 , rainbow trout , ecotoxicology
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