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Directing Neural Stem Cell Differentiation Using Nanopatterned Substrates and Visualization of the Developing Nervous System

Gojak, Christian Philip

German Title: Differenzierung von Neuralen Stammzellen auf Nanostrukturierte Oberflächen und Visualisierung des Heranwachsenden Nervensystems

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Abstract

The development of neural stem cells is regulated by a variety of growth and cell adhesion factors. A promising approach to direct their differentiation in vitro is the generation of cell substrates that replicate the intricate physical and biochemical properties of their cellular environment. The primary aim of this work was to develop cell substrates that mimic these properties and explore their potential in directing the differentiation of embryonic neural stem cells and in supporting axonal outgrowth. For this, gold nanopatterned glass substrates were used for the controlled immobilization of proteins. The resulting substrates feature nanopatterned cell signaling proteins at variable surface density, as well as additional cell adhesive molecules. The role of both factors in regulating the differentiation of mouse embryonic neural stem cells was investigated independently. Differentiation of neural stem cells on substrates uniformly coated with the cell adhesion molecules laminin, fibronectin and N-cadherin showed no effect on the in vitro generation of newborn neurons in comparison to polyornithine controls. Moreover, a 2,5-fold increase in cell number was observed on all cell-adhesion molecules, indicating an increase in cell proliferation. Furhermore, the role of cell adhesion molecules in supporting axonal outgrowth of dorsal root ganglia explants was investigated. The longest axonal projections ranging up to 800µm could be observed on laminin-coated substrates. In contrast, outgrowth on fibronectin as well as fibronectin-derived peptide nanopatterned substrates resulted in 200-250µm long projections. The role of nanopatterned Notch cell receptor ligand Delta-like 1 (Dll-1) substrates in directing the differentiation of neural stem cell cultures was investigated using variable ligand densities. As a result, Notch activation resulted in increased neurite number, branching, and cell body size. The strongest response was observed using 340 ligands/µm2 (56nm interparticle spacing) in comparison to 735 ligand/µm2 (90nm) and uniformly coated Dll-1 substrates. Additionally, a small fraction of drastically enlarged neurons was observed on Dll-1 substrates, but no effect on the total number of newborn neurons. The next aim of this thesis was to develop a system for the non-invasive visualization of the embryonic nervous system. For this, a transgenic mouse line that expresses high levels of green fluorescent protein (GFP) specifically in newborn neurons was characterized. Imaging using light sheet fluorescence microscopy resulted in high- resolution visualization of the entire nervous system in whole embryos allowing for generation of three-dimensional models and virtual specimen sectioning. Additionally, this technique was successfully applied for the visualization of innervation defects caused by mutation of the axonal-guidance protein Semaphorin 3A. In summary, the nanopatterned protein substrates presented in this work constitute a powerful tool for influencing in vitro development of neural stem cells. Additionally, the introduced transgenic mouse featuring GFP-expressing neurons allows for highly detailed visualization of the developing nervous system in whole embryos.

Translation of abstract (German)

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Zellsubstraten, welche diese Eigenschaften nachbilden, sowie deren Anwendung zur Untersuchung der neuralen Stammzelldifferenzierung und des axonalen Wachstums. Hierfür wurden Gold nanostrukturierte Glasoberflächen zur kontrollierten Anbindung von Proteinen verwendet. Die resultierenden Zellsubstrate verfügen über nanostrukturierte zellsignalisierende Proteine variabler Oberflächendichte und zusätzlichen zelladhäsiven Molekülen. Der Einfluss beider Faktoren auf die Differenzierung von embryonalen neuralen Stammzellen aus der Maus wurden anschließend einzeln untersucht. Die Differenzierung neuraler Stammzellen auf zelladhäsiven Substraten beschichtet mit Laminin, Fibronektin oder N-cadherin, zeigte im Vergleich zu Polyornithin keinen Einfluss auf den Anteil in vitro generierter Neuronen. Jedoch führten diese Proteine zu einem 2,5-fachen Anstieg der Gesamtzellzahl, was auf einen Proliferationszuwachs hindeutet. Zusätzlich wurde die Auswirkung von Zelladhäsionsmoleküle auf das Auswachsen von Axonen aus Spinalganglien Explantate untersucht. Auf Laminin beschichtete Oberflächen konnten axonale Fortsätze bis zu 800µm beobachtet werden. Im Vergleich hierzu zeigten auswachsende Axone auf Fibronektin beschichtete Oberflächen und auf nanostrukturierte Susbtrate aus Fibronektinpeptiden eine Gesamtlänge vom 200-250µm. Die Untersuchung der neuronalen Stammzelldifferenzierung auf nanostrukturierten Notch Rezeptor Delta-like 1 (Dll-1) Substraten zeigte eine Erhöhung der Anzahl und der Verzweigunng von Neuriten, sowie eine Vergrößerung des Zellkörpers in Neuronen. Dieser Effekt war bei einer Ligandendichte von 340 µm-2 (56nm mittlerer Zwischenabstand) am stärksten. Bei einer Dichte von 735 µm-2 (90nm) sowie homogen beschichteten Dll-1 Substrate war die Zellantwort schwächer ausgeprägt. Zusätzlich wies ein geringer Anteil der auf Dll-1 Substrate differenzierten Neuronen eine drastisch vergößerte Morphologie. Jedoch konnte kein Einfluss auf den Gesamtanteil an in vitro differenzierten Neuronen festgestellt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, ein System zur nicht-invasiven Visualisierung des heranwachsenden Nervensystems zu erarbeiten. Hierfür wurde eine transgene Mauslinie, die ein starke neuronenspezifische Expression von grün fluoreszierendes Protein (GFP) aufweist, charakterisiert. In Kombination mit Lightsheet Fluoreszenzmikroskopie konnte eine hochauflösende Visualisierung des gesamten Nervensystems in Mausembryonen erreicht werden. Die hiermit generierten Daten ermöglichten ferner die Erstellung von dreidimensionalen Modellen und eine virtuelle Sezierung der Embryonen. Des weiteren wurde mit dieser Methode die Visualisierung von Innervationsdefekten aufgrund einer Mutation des Proteins Semaphorin 3A demonstriert, welches zur axonalen Lenkung beiträgt. Zusammengefasst stellen die in dieser Arbeit vorgestellten nanostrukturierten Proteinsubstrate eine vielversprechende Methode zur Beeinflussung der in vitro Differenzierung neuraler Stammzellen dar. Darüber hinaus ermöglicht die in dieser Arbeit charakterisierte Mauslinie eine hochauflösenden Visualisierung des heranwachsenden Nervensystems in ganzen Embryonen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim P.
Date of thesis defense: 25 June 2012
Date Deposited: 31 Jul 2012 11:02
Date: 2012
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Biophysikalische Chemie, Neurobiologie
Uncontrolled Keywords: Biophysical Chemistry , Neurobiology
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