Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

CD40-vermittelte von Willebrand Faktor-Freisetzung aus humanen Endothelzellen

Möller, Kerstin

English Title: CD40-mediated von Willebrand factor release from human endothelial cells

[img]
Preview
PDF, German Print-on-Demand-Kopie (epubli)
Download (5Mb) | Lizenz: Print on Demand

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Arteriosklerose ist eine chronisch entzündliche Gefäßerkrankung, deren klinische Manifestationen wie Herzinfarkt, Schlaganfall und Herzinsuffizienz über 40% aller Todesfälle in den westlichen Industrienationen verursachen. Arteriosklerotische Läsionen treten in den großen Arterien, vor allem an Gefäßverzweigungen oder Biegungen auf. In diesen Bereichen herrscht eine niedrige oszillierende Schubspannung bei gleichzeitig verstärkter zyklischer Deformation der Gefäßwand. Die so veränderten hämodynamischen Bedingungen haben eine erhöhte Expression von CD40 in den Endothelzellen zur Folge. Die kostimulatorische Interaktion des CD40-Rezeptors mit seinem Liganden CD154 spielt nicht nur bei der adaptiven Immunantwort, sondern auch bei der Aktivierung von Endothelzellen und der verstärkten Rekrutierung von Entzündungszellen in der Initialphase der Arteriosklerose eine entscheidende Rolle. In dieser Arbeit wurde die Hypothese untersucht, dass die Interaktion von thrombozytärem CD154 mit dem CD40-Rezeptor der Endothelzellen zu einer luminalen Freisetzung des für Thrombozyten hochadhäsiven von Willebrand Faktors (vWF) aus den Endothelzellen führt. Die anschließende Deposition des vWF auf der Endothelzelloberfläche als ultralange vWF-Multimere schafft die Voraussetzung für eine stabile Interaktion zwischen intakten Endothelzellen, Thrombozyten und Leukozyten an den vorgenannten Prädilektionsstellen für die Arteriosklerose und deren Initiierung. In den durchgeführten Experimenten wurden humane, primär kultivierte Endothelzellen sowohl unter niedrigen, oszillatorischen Schubspannungs- als auch unter statischen Bedingungen mit rekombinantem löslichen bzw. zellgebundenem humanen CD154 stimuliert. Diese Stimulation induzierte eine luminale Freisetzung von vWF und eine Fluss-induzierte vWF-Multimer-Bildung auf der Endothelzelloberfläche, die mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen visualisiert und mit einem spezifischen ELISA quantifiziert werden konnte. Der nach CD40-Stimulation freigesetzte vWF wies eine starke Assoziation zur Endothelzelloberfläche auf, während Histamin als Kontrollstimulus eine prominente vWFFreisetzung in den Zellüberstand induzierte. Mit Hilfe pharmakologischer Inhibitoren, Western Blot-Analysen und Fura-2-Ratio Imaging bzw. dem Fluo-4-gestützten Nachweis von Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration konnte gezeigt werden, dass für die CD154-stimulierte Exozytose von vWF aus den Weibel-Palade Körperchen der Endothelzellen ein klassischer calciumabhängiger Signalmechanismus verantwortlich ist. Eine durch CD40-Ligation aktivierte Phosphotyrosinkinase der Src-Familie aktiviert die Phospholipase Cg1, die über die Bildung des sekundären Botenstoffs IP3 Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum freisetzt. Eine Beteiligung der Proteinkinase C und der Proteinkinase A konnte ebenso ausgeschlossen werden wie ein Einstrom von extrazellulärem Calcium durch Ionenkanäle in der Plasmamembran. In isoliert perfundierten Blutgefäßen der Maus führt diese CD154-stimulierte luminale vWF-Freisetzung aus den Endothelzellen tatsächlich zu einer verstärkten Rekrutierung und Aktivierung von Thrombozyten, die ihrerseits Monozyten zu den Zell-Zell-Kontakten der Endothelzellen dirigieren. Da CD154-stimulierte Endothelzellen selbst CD154 exprimieren und dadurch die transmigrierenden Monozyten zu einer Differenzierung zu Makrophagen anregen, könnte diese vWF-verstärkte Endothelzellen-Thrombozyten-Leukozyten- Interaktion in der Tat eine entscheidende Rolle in der Initiierung der Arteriosklerose spielen. Inwieweit sich aus diesen Befunden ein neuer therapeutischer Ansatz zur Vermeidung dieser chronisch-entzündlichen Gefäßerkrankung entwickeln lässt, müssen weiterführende Untersuchungen insbesondere in tierexperimentellen Modellen zeigen.

Translation of abstract (English)

Atherosclerosis is a chronic inflammatory, vascular disease and its manifestation as myocardial infarction, stroke or heart failure causes more than 40% of all deaths in industrialized countries. Atherosclerotic lesions preferentially develop at vessel bifurcations or curvatures of large arteries. These areas are exposed to low oscillatory shear stress and coincidentally enhanced cyclic stretch, which leads to an increased expression of CD40 by the endothelial cells. Interaction of CD40 ligand (CD154) with its receptor CD40 not only plays a role in both innate and adaptive immunity, but also activates endothelial cells and likely promotes inflammatory cell recruitment during the initiation and progression of atherosclerosis. This work investigates the hypothesis that ligation of platelet CD154 with endothelial CD40 induces a luminal release of von Willebrand factor (vWF), which is highly adhesive for platelets, from structurally and functionally intact endothelial cells. Subsequent deposition of vWF as ultra-large vWF-multimers on the endothelial surface possesses pathophysiological relevance for a stable interaction between healthy endothelial cells, platelets and leukocytes at atherosclerotic predilection sites and for the initiation of atherosclerosis. Primary human endothelial cells were cultured under low oscillatory shear stress as well as static conditions and treated with recombinant soluble or cell-bound human CD154. This stimulation led to the luminal release of vWF and to flow-induced vWF-multimerization on the endothelial surface visualized using immunofluorescence staining and quantified by using a specific ELISA. CD40-stimulated vWF release was strongly associated with vWF deposition on the endothelial cell surface, whereas stimulation with histamine as positive control induced a prominent release of vWF into the cell supernatant. Using pharmacological inhibitors, Western blot analysis and calcium imaging with Fura-2 or Fluo-4 revealed a classical calcium-dependent signalling mechanism mediating the CD154-stimulated vWF exocytosis from the Weibel-Palade bodies of the endothelial cells. Thus CD40 ligation induces phosphorylation of a tyrosine kinase of the Src-family, subsequent activation of phospholipase Cg1 and synthesis of IP3 which through binding to its receptor causes the release of calcium from the endoplasmic reticulum calcium store. Involvement of protein kinase C or protein kinase A as well as an entry of extracellular calcium through ion channels in the plasma membrane could be excluded. In isolated perfused mouse arteries, CD154-stimulated luminal vWF release from the endothelial cells indeed leads to an enhanced recruitment and activation of platelets, and subsequent direction of monocytes to the endothelial cell-cell-contacts. Since CD154-stimulated endothelial cells themselves express CD154 and thereby may induce the differentiation of transmigrating monocytes to macrophages, this vWF-reinforced endothelial cell-plateletleukocyte- interaction may in fact play a crucial role in the initiation of atherosclerosis. The extent to which these findings can be used to develop a new therapeutic approach to prevent this chronic inflammatory disease, has to be investigated further especially using animal models.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hecker, Prof. Dr. Markus
Date of thesis defense: 25 June 2012
Date Deposited: 04 Jul 2012 08:57
Date: 2012
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut fuer Physiologie und Pathophysiologie
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Endothelzellen , von Willebrand Faktor , CD40endothelial cell , von Willebrand factor , CD40
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative