German Title: Antikörper microarray-basierend auf zellulären Oncoproteomics

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Abstract

Seit ihrer kürzlichen Einführung haben sich Antikörper-Microarrays schnell als leistungsstarke, robuste und empfindliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen des Proteoms etabliert. Sie erlauben ein breites Spektrum an Anwendungen, mit Schwerpunkt im Bereich biomedizinischer Wissenschaft und klinischer Forschung. Allerdings waren Antikörper-Microarrays bisher hauptsächlich für die Analyse von Serum- und Urinproben ausgelegt. Zell-Lysate und Gewebe-Extrakte stellten eine große Herausforderung hinsichtlich Qualität und Verlässlichkeit dar. In der hier präsentierten Arbeit wurden eine Reihe technischer Aspekte zur Anwendungsreife gebracht, die für eine Analyse von Zell-Extrakten essenziell sind, und für Studien an Tumorzellen und Krebsgeweben genutzt. Die Extraktion einer möglichst vollständigen Repräsentation eines zellulären Proteoms ist ein kritischer Schritt für jede Art der Proteinanalyse. Zwar gab es bereits Methoden und entsprechende Reagenzien sind kommerziell erhältlich, aber die vorhandenen Verfahren für ein Proteinextraktion aus Zellen und Geweben waren völlig unzureichend für Studien mit Antikörper-Microarrays und wurden deshalb detailliert bearbeitet. Als Ergebnis wurde ein effektives Ein-Schritt-Extraktionsverfahren von hoher Reproduzierbarkeit entwickelt, das es erlaubt, Proteine unter nativen Bedingungen aus Zellen und Geweben zu isolieren. Im Vergleich zu bekannten Methoden sind die Ausbeuten signifikant besser, speziell auch für membran-assoziierte Proteine und Moleküle aus Zellkompartimenten. Gleichzeitig wird die Funktionalität der Proteine wesentlich besser erhalten. Die mit dem Protokoll gewonnenen Proteinextrakte zeigen eine hohe Kompatibilität mit Studien auf Antikörper-Microarrays. Zusätzlich wurden Parameter der Array-Analyse untersucht und optimiert, so dass eine robuste Analyse von komplexen zellulären Proteinextrakten möglich wurde. Unter anderem wurden Faktoren wie (i) die Pufferzusammensetzung zur Blockierung der Oberflächen gegen unspezifische Bindung, (ii) die Dauer der Blockierung, (iii) Proteinhandhabung und Prozessierung, (iv) Parameter des arkierungsprozesses und des Entfernens überschüssigen Farbstoffs, als auch (v) Inkubationsparameter wie etwa Pufferzusammensetzung, Dauer, Temperatur und Probenmischung analysiert und optimiert. Mit den entwickelten Verfahren wurden die Proteome von 24 Pankreaskrebs Zelllinien und zwei Kontroll-Zelllinien mittels eines Microarrays untersucht, der 810 Antikörper gegen 741 Proteine trug, die mit Krebserkrankungen assoziiert sind. Weiterhin wurden in einer Studie zum Verständnis der molekularen Hintergründe von Pankreaskrebs mehr als vierhundert Gewebeproben von Tumorpatienten und aus gesundem Gewebe analysiert.

Translation of abstract (English)

Since its recent introduction, antibody microarray technology has emerged as a powerful, robust, and sensitive tool for proteomic analyses. It enables a broad spectrum of applications, with a particular focus in biomedical sciences and clinical research. However, to date, antibody array platform protocols had been designed predominantly for the analyses of serum or plasma samples. The analysis of cell lysates and tissue homogenates posed therefore a significant challenge with respect to quality and reliability. In the work presented here, several technical issues that are crucial for the performance of such studies were established and applied to the analysis of cancer cells and tissues. The process of extracting comprehensive proteome representations is a critical step in any proteomic investigation. While many such techniques have been described and are even commercially available, the existing processes for protein extraction from tissues were entirely inadequate for antibody array studies and thus addressed in detail. As a result, a single-step extraction procedure was developed for the isolation of proteins from mammalian tissues under native conditions in an effective and reproducible manner. Compared to existing processes, a substantially higher protein recovery was achieved, particularly of membrane as well as compartmental proteins. Also, an overall much better preservation of protein functionality was achieved. The resulting protein extracts exhibit a high compatibility with antibody microarray studies. Moreover, assay protocols were established, refined and optimized so that robust analyses of protein extracts from mammalian tissues and cells became possible. The optimized analytical factors of the array assay were (i) the buffer composition for blocking the array surface against unspecific protein binding, (ii) blocking duration, (iii) protein handling and processing, (iv) labeling parameters like type of dye, molar ratio of label versus protein, and dye removal, as well as (v) incubation parameters such as buffer composition, duration, temperature, and sample agitation. With the new, optimized setup, the cellular proteomes of 24 pancreatic cancer cell lines and two controls were investigated using an antibody microarray that targets 741 cancerrelated proteins. The protocol is being used further for the analysis of hundreds of pancreatic cancer tissue samples in an ongoing application of the array in oncoproteomics.