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Functional characterization of the Arabidopsis thaliana gene Cysteine Three Histidine 2

Reuscher, Stefan

German Title: Funktionelle Charakterisierung des Arabidopsis thaliana Gens Cysteine Three Histidine 2

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Abstract

The aim of this thesis was to functionally characterize the Cysteine Three Histidine 2 (CTH2)gene in the model plant Arabidopsis thaliana, which is a candidate for a role in plant iron homeostasis. AtCTH2 belongs to the family of tandem zinc-finger proteins (TZF) which are known to bind and initiate the degradation of mRNAs in other organisms. The closest homologue of AtCTH2 in yeast is negatively regulating the stability of a group of specific transcripts under iron-deficient conditions. Heterologous expression of an Arabidopsis CTH2 cDNA can complement a yeast cth1Δcth2Δ mutant. Here it was shown that AtCTH2 partly co-localizes with a marker of plant stress-granules in Arabidopsis protoplasts. Localization to these sites of transcript degradation is an indication that CTH2 plays a role in post-transcriptional regulation of gene expression by influencing transcript stability. Two mutants carrying T-DNA insertions in CTH2 were identified and characterized. The two mutants showed different phenotypes, which was attributed to different partial CTH2 transcripts originating at the CTH2 locus. The results suggested that the partial transcript found in cth2-1 caused a dominant hypersensitivity to iron deficiency, and possibly represents a gain-of-function allele. Most affected were the youngest leaves, which showed a drastic reduction of chlorophyll concentrations and reduced growth, when compared to wild-type plants grown under the same conditions. The total content of iron in the youngest leaves was not affected by the cth2-1 mutation, which showed that long-distance iron reallocation under Fe-deficient conditions is not disturbed. The cth2-2 allele caused sporophytic male sterility, and is recessive. In homozygous cth2-2 plants tetrads of microspores are found, but instead of separating into individual microspores, the cells enlarged, showed granular structures, and eventually degenerated. In accordance with this, the activity of the CTH2 promoter was localized to the connective tissue during the release of microspores from tetrads. The developmental defect might be caused by a disturbed iron homeostasis, since iron content was lower in cth2-2 anthers then in wild-type anthers. A microarray analysis identified several candidate pathways and categories of genes, in which transcript levels are over-proportionately misregulated in cth2-2 anthers compared to wildtype anthers. In summary, it was shown that CTH2 has a role in Arabidopsis thaliana iron homeostasis and is critical for anther development. In both roles CTH2 is the first described RNA-binding protein in a plant to act in these roles.

Translation of abstract (German)

Das Ziel dieser Arbeit war es das Cysteine Three Histidine 2 (CTH2) Gen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, mit Hinblick auf eine mögliche Rolle in der pflanzlichen Eisenhomöostase funktionell zu charakterisieren. AtCTH2 gehört zur Familie der Tandem Zink-Finger Proteine (TZF), von denen aus anderen Spezies bekannt ist, dass sie an mRNAs binden können und so deren Abbau einleiten. Dass am nächsten verwandte Protein aus Hefe, ScCTH2 reguliert die Genexpression in Hefe unter Eisenmangelbedingungen durch den Abbau einer spezifischen Gruppe von Transkripten. Eine cth1Δcth2Δ Hefemutante kann durch heterologe Expression einer Arabidopsis CTH2 cDNA funktionell komplementiert werden. Durch transiente Expression in Arabidopsis Protoplasten konnte gezeigt werden, dass AtCTH2 teilweise in „plant stress granules“ lokalisiert ist. Die teilweise Lokalisierung an Orten des Transkript-Abbaus ist ein Indiz dafür, dass CTH2 die Transkript-Stabilität negativ beeinflusst. In dieser Arbeit wurden zwei T-DNA Insertionsmutanten mit Insertionen im CTH2 Lokus identifiziert und charakterisiert. Es stellte sich heraus, dass diese Mutanten unterschiedliche Phänotypen zeigen, was auf unterschiedliche partielle CTH2 Transkripte zurückgeführt werden konnte. Ein partielles CTH2 Transkript, welches in der cth2-1 Mutante gefunden wurde, verursachte eine dominante Hypersensitivität gegenüber Eisenmangel, und repräsentiert möglicherweise ein „gain-of-function“ Allel. Am stärksten betroffen waren die jüngsten Blätter, welche eine drastische Verringerung des Chlorophyllgehaltes und ein verringertes Wachstum im Vergleich zum Wildtyp zeigten. Es konnte ferner gezeigt werden, das der Gehalt an Fe in den jüngsten Blättern durch die cth2-1 Mutation nicht beeinflusst wurde, was zeigt, dass die Reallokation von Eisen unter Eisenmangelbedingungen nicht gestört war. Das rezessive cth2-2 Allel bewirkte die sporophytische männliche Sterilitat der Pflanzen. In homozygoten cth2-2 Pflanzen wurden zwar Mikrosporen gefunden, allerdings entwickelten sich diese nicht zu reifem Pollen. Stattdessen wurden vergrößerte Zellen mit granulären Strukturen gefunden, die später degnerierten. Dazu passend war der CTH2 Promoter während der Freisetzung der Mikrosporen aus den Tetraden aktiv im Konnektivgewebe. Die Antheren von cth2-2 Pflanzen enthielten weniger Eisen als Antheren von WT oder cth2-1 Pflanzen, was auf eine mögliche Rolle von CTH2 in der Eisenhomöostase während der Antherenentwicklung hinweist. Durch Transkriptmengenanalyse in Antheren mittels „Microarrays“ konnten verschiedene Stoffwechselwege und Kategorien von Genen gefunden werden, die im Vergleich zum Wildtyp in cth2-2 Antheren dereguliert sind. Zusammenfassed wurde gezeigt, dass CTH2 eine Rolle beim Wachstum unter Eisenmangelbedingungen spielt und für die Entwicklung des männlichen Gametophyten erforderlich ist. In beiden Funktionen ist es das erste beschriebene RNA-bindende Protein in Pflanzen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krämer, Prof. Dr. Ute
Date of thesis defense: 24. August 2012
Date Deposited: 27. Aug 2012 13:55
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 580 Botanical sciences
Controlled Keywords: Botanik, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Pflanzenphysiologie, Pflanzenernährung, RNS-Stoffwechsel, Messenger-RNS, Eisenstoffwechsel, Eise
Uncontrolled Keywords: RNS-Stabilität , EisenhomöostasePlant Physiology , Iron Homeostasis , RNA Stability , Arabidopsis thaliana , Anther development
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