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ARCHITECTURE OF DROSOPHILA DOSAGE COMPENSATION COMPLEX

Hallacli, Erinc

German Title: ARKITEKTUR DES DROSOPHILA DOSISKOMPENSATIONSKOMPLEXES

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Abstract

In heterogametic organisms, male and female cells harbor structurally different sex chromosome pairs. The difference in the transcriptional output of these sex chromosomes is epigenetically balanced, a phenomenon dubbed as dosage compensation. In Drosophila, male cells up-regulate their one X chromosome roughly two times by the help of a molecular machine called MSL complex. This ribonucleoprotein enzymatic complex, specifically formed in male cells, localizes to the X-chromosome, changing its structure mostly by histone H4 Lysine 16 acetylation, thus enabling enhanced transcription. The details of how the complex finds the chromosome and how it regulates transcription are not thoroughly understood. In this thesis, with the help of X-ray crystallography, we derived point mutations on the scaffold Msl1 protein that create partial complexes to study the contribution of each subunit to X chromosome recognition, RNA integration and spreading alone the X chromosome. In the first part of this thesis, we focused on the PEHE region of Msl1 protein that binds Mof and Msl3. We generated point mutants of Msl1 that cannot bind Mof or Msl3. We showed that loss of either Mof or Msl3 prevents spreading of the MSL complex on the body of the X-linked genes whereas Msl1 promoter binding remained unaffected. We observed qualitative differences between high affinity sites (HAS), initial binding platforms of MSL complex, and noticed that promoter located HAS can bind Msl1 independent of Mof and Msl3 whereas other HAS depend on the presence of intact PEHE module for optimal binding. In the second part of the thesis, we examined the interaction of Msl1 and Msl2 and showed that Msl1 forms a homodimer through its coiled coil region and this homodimer creates a platform for Msl2 binding. Msl2 binding happens through helices surrounding the RING finger domain. We showed that Msl2 RING finger can function as a ubiquitin ligase, and Msl1 is an in vitro substrate of Msl2 ubiquitination. By point mutational analysis on Msl1 we showed that Msl1 forms a dimer independent of Msl2 in both male and female cells. Dimerization is required for Msl2 binding, roX2 RNA integration to the complex, X chromosome recognition and spreading along the body of X-linked genes. This clearly showed that functionality of MSL complex entirely depends on its dimeric configuration. We identified roX2 HAS as an elementary HAS where its recognition only happens through Msl1-Msl2 dimer interface. Furthermore we discovered that Msl1 binds to promoters in a dimer/Msl3/Mof/Msl2 independent fashion. This binding occurs also at the autosomes and in both sexes suggesting a general function of Msl1 at promoters of Drosophila. We showed that promoters are also occupied by Msl2 but not by Msl3, indicating that Msl3 can have an important role for distinguishing promoter bound complex and canonical MSL complex. In order to support the in vivo importance of amino acid residues that had been point mutated, we generated transgenic flies that express Msl1 and its mutated forms from the identical genomic location. We showed Msl1 mutants are unable to rescue the Msl1 null male lethality and also cause male specific lethality upon over-expression in wild type background confirming the importance of these mutated residues.

Translation of abstract (German)

Männliche und weibliche Zellen heterogameter Organismen enthalten einen unterschiedlichen Satz von Geschlechtschromosomen. Die daraus resultierenden Unterschiede in der Genexpression werden oft durch epigenetische Mechanismen ausgeglichen, ein Phänomen bekannt als Dosiskompensation. Mittels einer molekularen Maschinerie genannt MSL Komplex erhöhen männliche Zellen in Drosophila die Genexpression ihres einzelnen X chromosoms ungefähr um den Faktor zwei. Dieser enzymatische Ribonucleoproteinkomplex, spezifisch gebildet in männlichen Zellen, bindet an das X Chromosom, ändert dessen Struktur hauptsächlich durch die Acetylierung von Histon H4 an Lysin 16, und ermöglicht dadurch eine verstärkte Transkription. Wie genau der MSL Komplex das X chromosom erkennt und die Transkription reguliert ist nicht im Detail verstanden. Mit Hilfe von röntgenkristallographischen Daten haben wir in dieser Arbeit Puntkmutationen in Msl1 generiert die zum Verlust einzelner Faktoren aus dem MSL Komplex führen, um so deren Beiträge zur X Chromosom Erkennung, RNA Integration und zum „spreading“ des MSL Komplexes entlang des X Chromosoms zu studieren. Der Fokus des ersten Teils dieser Arbeit liegt auf der PEHE region des Msl1 Proteins welche mit Mof und Msl3 interagiert. Wir haben Msl1 Punkmtutante erzeugt die nicht mehr an Mof oder Msl3 binden können. Wir zeigen dass sowohl der Verlust von Mof als auch von Msl3 aus dem MSL Komplex dessen „spreading“ in den transkribierten Teil X chromosomaler Gene verhindert, wobei die Bindung von Msl1 an die Promoteren derselben Gene erhalten bleibt. Desweiteren beobachten wir qualitative Unterschiede zwischen verschiedenen „high affinity sites“ (HAS), den initialen Bindestellen des MSL Komplexes, insoweit dass HAS an Promotoren Msl1 unabhängig von Mof und MSl3 rekrutieren können während die optimale Bindung von Msl1 an andere HAS von einer intakten PEHE Domäne abhängig ist. Im zweiten teil dieser Arbeit haben wir die Interaktion zwischen MSl1 und Msl2 untersucht und zeigen dass Msl1 mit seiner coiled-cloil Domäne ein Homodimer bildet welches als Plattform für die Bindung an Msl2 dient. Diese Interaktion wird in Msl2 durch Helices um die RING Finger Domäne vermittelt. Wir zeigen dass der Msl2 RING Finger eine Ubiquitin-Ligase Aktivität aufweist und dass Msl1 ein in vitro Substrat für Msl2 vermittelte Ubiquitilierung ist. Durch Einbringung von Punktmutationen in Msl1 zeigen wir dass dessen Dimerisierung in männlichen und weiblichen Zellen unabhängig von Msl2 stattfindet. Msl1 Dimerisierung ist erforderlich für die Bindung an Msl2, roX2 Integration in den MSL Komplex, X Chromosom Erkennung, und „spreading“ in den transkribierten Teil X chromosomaler Gene. Diese Ergebnisse zeigen deutlich dass die Funktion des MSL Komplexes von seiner Konfiguration als Dimer abhängig ist. Wir identifizieren die roX2 HAS als elementare HAS welche vom Msl1-Msl2 Dimer alleine erkannt wird. Desweiteren fanden wir das Msl1 Promotoren unabhängig von Dimerisierung/Msl3/Mof/Msl2 erkennt. Diese Interaktion findet auch an Autosomen statt und legt eine generelle Funktion von Msl1 an Genpromotoren in Drosophila nahe. Wir zeigen dass diese Promotoren auch von Msl1 aber nicht von Msl3 besetzt sind, was nahe legt dass Msl3 eine wichtige Rolle zur Unterscheidung des Promoter-Komplexes gegenüber dem klassischen MSL Komplex spielt. Um die Signifikanz der oben beschriebenen Aminosäuren in Msl1 weiter zu untermauern haben wir transgene Fliegen erzeugt welche die mutierten Formen von Msl1 vom selben genomischen Locus exprimieren. Wir zeigen dass diese Msl1 Mutanten nicht in der Lage sind die Männchen spezifische Lethalität in Abwesenheit von endogenem Msl1 zu beheben, und dass die Überexpression derselben Muanten in Anwesenheit von endogenem Msl1 ebenfalls zu männlicher Lethalität führt. Diese Ergebnisse bestätigen die zentrale Rolle der mutierten Aminosäurereste für die Funtkion von Msl1.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Haering, Dr. Christian
Date of thesis defense: 24 July 2012
Date Deposited: 03 Sep 2012 08:20
Date: 2012
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Drosophila dosage compensation , chromatin
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