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Untersuchung des Einflusses biomechanischer Dehnung auf den Phänotyp venöser und arterieller glatter Gefäßmuskelzellen

Feldner, Anja

English Title: Analysis of the influence of biomechanical stretch on the phenotyp of venous and arteriell smooth muscle cells

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Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen nach wie vor mit Abstand die Haupttodesursache in der westlichen Welt dar. Daher ist ein besseres Verständnis der Ursachen und Prozesse, die zur Entstehung und dem Verlauf dieser Erkrankungen beitragen, essentiell für die Entwicklung neuer Therapiestrategien. Biomechanische Kräfte, wie z.B. eine Erhöhung der Gefäßwandspannung sind von entscheidender Bedeutung für die Initiierung von pathophysiologischen Remodellierungsprozessen in Gefäßen, wie z.B. dem Hypertonie-induzierten arteriellen Gefäßumbau oder der Bildung variköser Venen. Ziel dieser Arbeit war es, mehr über die diesen Remodellierungsprozessen zugrundeliegenden molekularen und zellulären Mechanismen herauszufinden. Durch Verwendung eines Mausmodells, bei dem durch Ligation einer Vene der Ohrmuschel der Veneninnendruck erhöht wird, konnten histologische und anatomische Anpassungs-vorgänge in der Wand der remodellierenden Venen beobachtet werden, die solchen in varikös veränderten Venen sehr ähnlich sind. So ergaben die entsprechenden ex vivo und in vitro-Analysen, dass die Proliferationsaktivität generell sowie die Expression und Aktivität der Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2) in den Endothel- und glatten Muskelzellen der druckbelasteten und insofern überdehnten Venenwand signifikant erhöht ist. Bei diesem Umbauprozess kommt dem Transkriptionsfaktor Aktivator Protein-1 (AP-1) und insbesondere dessen Untereinheit Junb offenbar eine wichtige Rolle zu, da die Neutralisierung des Transkriptionsfaktors mithilfe eines Decoy-Oligodesoxynukleotids (dODN) sowie der Verlust der Junb-Untereinheit die zuvor genannte proteolytische Aktivität nachhaltig verhindert. Ein Vergleich des Phänotyps der Gefäßwandzellen im Ohrmuschel-Mausmodell mit dem in humanen Varizen unterstreicht darüber hinaus, dass durch den verwendeten in vivo Ansatz erstmalig entscheidende Prozesse der Varizenbildung beim Menschen in einem Tiermodell dargestellt werden konnten und dieses insofern eine interessante Option für die Testung neuartiger Präventions- bzw. Therapiestrategien darstellt. Bei der Beantwortung der Frage, inwieweit AP-1 oder Junb auch bei Hypertonie-induzierten Remodellierungsprozessen in Arterien bzw. Arteriolen von Bedeutung sind, zeigte sich u. a., dass Junb-defiziente Mäuse keinen Bluthochdruck nach Gabe von Deoxycorticosteronacetat (DOCA)-Salz entwickeln. Auch die, mit der in diesem Modell normalerweise auftretenden Hypertonie assoziierten Adaptationsprozesse wie z.B. eine Linksherzhypertrophie blieben in den Junb-defizienten Mäusen aus. Ursache hierfür ist offenbar eine verminderte Fähigkeit der arteriellen glatten Muskelzellen zur Kontraktion, die auf eine deutlich verringerte Expression der leichten Kette des Myosins (MLC2), dem Schlüsselprotein für die dynamische Kontraktion dieser Zellen, zurückzuführen ist. Aus diesen Tieren isolierte Arterien zeigten des Weiteren eine deutlich Änderung in der Zusammensetzung ihrer extrazellulären Matrix, die Ausdruck einer Kompensation ihrer reduzierten Kontraktilität sein könnte. Junb ist daher in diesem Zusammenhang ein entscheidender Faktor für die glattmuskulärer Kontraktilität, da es u.a. die Expression von MLC2 direkt kontrolliert. Interessanterweise war in den Junb-defizienten Mäusen, trotz des verminderten MLC2-Spiegels, der basale Blutdruck und damit der Gefäßwiderstand praktisch unverändert. Auf der Suche nach Faktoren, welche die Kontraktionsfähigkeit der glatten Gefäßmuskelzellen positiv beeinflussen, zeigte sich in einem DNA-Microarrayansatz eine nahezu zehnfache Hochregulation der mRNA-Expression für Regulator of G-Protein Signalling 5 (RGS5), einem RGS-Protein für das ein Zusammenhang mit der Blutdruckregulation bereits beschrieben worden ist. Detaillierte Analysen der Funktion von RGS5 ergaben, dass dessen adenovirale Überexpression in glatten Gefäßmuskeln die über den Gq/11-PLCbeta-IP3-Signalweg vermittelte Kalziummobilisierung blockiert und die G12/13-Rho-Kinase-vermittelte Bildung von Stressfasern dagegen fördert. In Übereinstimmung damit führte der Verlust von RGS5 zu einer Steigerung der Agonisten-induzierten Kalziummobilisierung und einer verstärkten Kontraktion isoliert perfundierter Arteriensegmente aus RGS5-defizienten Mäusen, während die Stressfaserbildung in RGS5-defizienten glatten Gefäßmuskelzellen deutlich reduziert war. In tierexperimentellen Modellen, bei denen es zu einer adaptiven (Arteriogenese) bzw. maladaptiven (Hypertonie) Remodellierung von Arteriolen bzw. Arterien kommt, konnte ein Anstieg der RGS5-Expression in den glatten Muskelzellen der Mediaschicht nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung der Frage, welche Faktoren diese Erhöhung der RSG5-Expression bewirken, zeigte sich, dass einerseits die längerfristige Überdehnung der glatten Gefäßmuskelzellen (Hypertonie) und andererseits eine verstärkte Exposition dieser Zellen mit Stickstoffmonoxid (NO) und die Stimulation des cGMP-Proteinkinase G-Signalwegs hierfür verantwortlich sind. NO wird im Rahmen der Arteriogenese durch den erhöhten Fluss in den kollateralen Arteriolen vermehrt aus den Endothelzellen freigesetzt. Die resultierende RGS5-Expression in den glatten Muskelzellen dieser Arteriolen scheint wichtig für das adaptive Wachstum der Kollateralgefäße zu sein, da dieser Remodellierungsprozess in RGS5-defizienten Mäusen nicht induziert werden kann. Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass es während venöser Remodellierungsprozesse primär zu einem verstärkten Umbau der extrazelluären Matrix kommt, um dem füllungsbedingt gesteigerten Innendruck und der daraus resultierenden Erhöhung der Wandspannung entgegenzuwirken. Arterien hingegen reagieren zunächst mit einer gesteigerten Kontraktion auf den erhöhten Innendruck. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Phänotypänderung der glatten Gefäßmuskelzellen vom kontraktilen zum synthetischen Zustand und einer maladaptiven hyperplastischen Remodellierung in der druckbelasteten Arterienwand. Durch die Hochregulation der Expression von Proteinen wie RGS5 verlieren die glatten Gefäßmuskelzellen dabei ihre Kontraktionsfähigkeit zugunsten einer erhöhten Steifigkeit. Sowohl für venöse als auch arterielle maldaptive Remodellierungsprozesse ist zudem die Aktivität des Transkriptionsfaktors AP-1 bzw. seiner Untereinheit Junb von besonderer Bedeutung. Wirkstoffe, die zu einer zellspezifischen Suppression der Aktivität bzw. Expression dieses Transkriptionsfaktors führen, könnten insofern einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention bzw. Regression dieser Remodellierungsprozesse in Venen bzw. Arterien darstellen. Dabei ist allerdings zu berücksichtigen, dass es unter Umständen zu einer Beeinträchtigung adaptiver Remodellierungsprozesse wie der Arteriogenese kommen kann.

Translation of abstract (English)

Cardiovascular diseases are still the major cause of death in industrial countries. Therefore, a better understanding of the causes and processes that contribute to the development and progression of these diseases is essential for the development of new therapeutic strategies. Biomechanical forces, e.g. an increase in circumferential wall tension, are crucial for the initiation of remodelling processes in blood vessels such as hypertension-induced arterial remodelling or the formation of varicose veins. The aim of this study was to investigate the underlying molecular and cellular mechanisms of these remodelling processes. By employing a mouse model, in which ligation of a major vein leads to a pathophysiological increase in venous pressure, the subsequent cellular adaptation processes in the wall of the remodelling veins were analysed. On the anatomical and histological level, the phenotype of these veins is similar to varicose veins in human patients. In this context, further ex vivo and in vivo studies indicate that the proliferation of endothelial and smooth muscle cells as well as their expression and activity of matrix metalloproteinase 2 (MMP2) is significantly increased due to the pressure-loaded and therefore overstretched venous vessel wall. The transcription factor activator protein-1 (AP-1) and especially its subunit Junb play an important role, as its neutralization by using a decoy oligodeoxynucleotide (dODN) as well as conditional ablation of Junb prevented the observed phenotypic changes in the endothelial and smooth muscle cells. Moreover, the novel mouse model has been proven as a versatile tool to mimic distinct steps of varicose vein formation of human patients and may thus represent an interesting option for the testing of novel preventive and/or therapeutic strategies. Concerning the question as to whether AP-1 or Junb also affect hypertension-induced remodelling of arteries and arterioles, it was revealed that Junb-deficient mice do not develop hypertension after administration of deoxycorticosterone acetate (DOCA)-salt. Consequently, hypertension-associated adaptations such as hypertrophy of the left ventricle were not observed in the Junb-deficient mice. This phenotype is mainly based on a clearly reduced contractile capacity of the arterial smooth muscle cells due to the significantly reduced expression of myosin light chain (MLC2) - a key protein for their dynamic contraction. Furthermore, isolated arteries from Junb-deficient animals showed a change in the composition of their extracellular matrix which may partially compensate for the reduced contractility. Thus, Junb appears to be an important determinant of the contractile capacity of vascular smooth muscle cells, as it directly controls MLC2 expression. Interestingly, Junb-deficient mice - despite having reduced MLC2 levels - have normal blood pressure at baseline indicating a normal peripheral vascular resistance. In the search for factors that positively affect vascular smooth muscle cell contractility, a DNA microarray approach was employed. Particularly striking was the almost ten-fold up-regulation of regulator of G-protein signalling 5 (RGS5) that belongs to a family of RGS proteins and has been associated with blood pressure regulation before. Detailed analyses of the function of this RGS protein revealed that its adenoviral-based overexpression in vascular smooth muscle cells blocks Gq/11-PLCbeta-IP3 mediated calcium mobilization but promotes G12/13-Rho kinase-mediated stress fibre formation. In line with this, loss of RGS5 resulted in an increased mobilization of intracellular calcium and an increased contraction of isolated perfused arterial segments from RGS5-deficient mice to G-protein-coupled receptor agonists. In contrast, stress fibre formation in RGS5-deficient vascular smooth muscle cells was significantly reduced. In animal models, a rise of RGS5 expression in the smooth muscle layer of the media was observed during adaptive (arteriogenesis) or maladaptive (hypertension) remodelling of arterioles and arteries. In this context, biomechanical stretch (hypertension), long-term exposure to nitric oxide (NO) and stimulation of the cGMP-protein kinase G pathway proved to be responsible for the increase in RSG5 expression in the vascular smooth muscle cells. During arteriogenesis, the increase in flow triggers the production and release of NO from endothelial cells of the remodelling collateral arterioles. The expression of RGS5 in arteriolar smooth muscle cells appears to be important for acquiring an activated and synthetic phenotype, as arteriogenesis is impaired in RGS5-deficient mice. Collectively, the results from this study suggest that venous remodelling is associated with reorganization of the extracellular matrix to counteract an increase in intraluminal pressure hence wall stress. Unlike veins, arteries respond to an increase in wall stress first by constriction. Subsequently, the phenotype of the arterial smooth muscle cells changes from the contractile to the synthetic phenotype hence promoting a maladaptive hyperplastic inward remodelling.. By up-regulating the expression of proteins such as RGS5, the vascular smooth muscle cells attempt to attenuate their contractile capacity thereby increasing their stiffness. Moreover, for maladaptive remodelling processes in both veins and arteries, the activity of the transcription factor AP-1 and its subunit Junb is of particular importance. Drugs that result in a cell-specific suppression of the activity or expression of this transcription factor could represent a promising approach for the prevention and/or regression of these remodelling processes. However, such therapies may impair adaptive remodelling processes such as arteriogenesis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hecker, Prof. Dr. Markus
Date of thesis defense: 26 September 2012
Date Deposited: 08 Nov 2012 08:38
Date: 2012
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut fuer Physiologie und Pathophysiologie
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Varikosis, Gefäßmuskelzelle, Junb, RGS5Varicosis, Hypertension, Smooth muscle cell, Junb, RGS5, Blutgefäß, Hypertonie
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