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Charakterisierung und Optimierung von CD276 spezifischen Peptiden mittels Display Techniken

Marr, Annabell

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PDF, German
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Abstract

In dieser Arbeit sollten spezifisch bindende Peptide gegen die extrazelluläre Domäne der Zielstruktur CD276, ein in verschiedenen Tumorarten überexprimiertes Membranprotein, identifiziert werden. Tumor spezifische Peptide finden in der Bildgebung sowie zielgerichteten Therapien Anwendung. Die hier identifizierten Peptide sollen als Leitstrukturen für neue Tracer zum Einsatz in der Bildgebung dienen. Die Selektion der Peptide erfolgte mit Hilfe der Phagenbibliothek Ph.D12 sowie selbst hergestellten Peptidbibliotheken basierend auf Miniprotein-Scaffolds und zwei verschiedenen Display Systemen, dem Phage- und Ribosome Display. Peptide wurden anschließend durch Fmoc-Festphasensynthese hergestellt, wenn nötig entsprechend gefaltet sowie mit 125I radiomarkiert und in Kinetik-, Kompetitions- sowie Internalisierungsstudien charakterisiert. Vor dem Einsatz in vivo an Tumor tragenden Nacktmäusen wurden zudem Stabilitätsstudien in Serum vorgenommen. Das Peptid CD276.11, welches der Ph.D.12 Bibliothek entstammt und mit Phage Display nach vier Panningrunden isoliert wurde, zeigte eine mit der CD276 Expression korrelierende Bindungsstärke an fünf verschiedenen Tumorzelllinien. Kompetitionsexperimente mit radiomarkiertem Peptid und unmarkiertem Peptid wiesen auf eine spezifische Bindung an CD276 hin. Ein IC50 Wert von 750 nM konnte ermittelt werden. Stabilitätsexperimente in humanem Serum ergaben eine t1/2 von fünf Minuten. Der Versuch der Stabilisierung sowie Fragmentanalysen führten zu dem Schluss, dass es sich bei dem in der Serumanalyse entstehenden Metaboliten um einen 125I Tyrosinrest handelte. Diese Vermutung konnte durch Bindungsstudien von markiertem Tyrosin auf Zellen sowie Kompetitionsversuche mit 125I-CD276 und unmarkiertem Tyrosin bestätigt werden. Ein weiteres nach vier Panningrunden mit der Ph.D.12 Bibliothek und dem Phage Display System identifiziertes Peptid, das PDGFR-P1, wurde bereits zuvor in zwei unabhängigen Pannings gegen das Membranprotein PDGFRβ isoliert. Ziel war es hier, die Bindung an beide Zielproteine zu bestätigen und die Affinität des Peptids zu steigern. Mittels Peptid-Arrays konnte gezeigt werden, dass das Peptid sowohl an CD276 als auch an PDGFRβ, nicht aber an das Kontrollprotein FGFR band. Durch gezielten Austausch einzelner Aminosäuren sowie einer Fragmentanalyse auf dem Peptid-Array konnte ein Peptid G2 mit erhöhter Affinität identifiziert werden, welches anschließend in vitro sowie in vivo charakterisiert wurde.

Translation of abstract (English)

Endoradiotherapy is a promising method to treat non-operable and metastasized tumors. A prerequisite of therapy success is tumor specific accumulation of the radioconjugates. Often tumor cells show a different proteome compared to normal cells and expression levels of proteins change. Due to the upregulation in cancer cells and the low expression or even absence in healthy tissue these molecules might be suitable targets for therapies and imaging. Aim of this study is to identify peptides specifically binding the extracellular domain of the membrane protein CD276 which is overexpressed in many different cancer types. Peptide screening was carried out with the purchased peptide library Ph.D.12 as well as self constructed libraries based on miniprotein scaffolds using two different display systems: Phage- and Ribosome Display. Biopanning was carried out using a 12-mer peptide library from NEB™ against the purified extracellular domain of CD276. After four selection rounds the phage vectors were sequenced and amino acids were chemically synthesized by fmoc-synthesis. In vitro characterization was carried out using different cell lines expressing CD276. Binding and metabolic stability was analyzed in cell assays after labelling the peptide with 125I. Stability tests were carried out with 125I labelled peptide in human serum followed by HPLC analysis. In vivo analysis was carried out with nude mice carrying xenografts. The peptide CD276.11 isolated with Ph.D.12 in Phage Display showed a correlation in binding affinity and expression level of CD276 on five different tumor cell lines. Competition experiments with 125I-CD276 and unlabeled peptide revealed a specific binding with a calculated IC50 of 750 nM. Stability experiments in human serum resulted in a stable metabolite. Due to metabolite formation after 1 minute in serum, CD276.11 needed to be stabilized for further application in vivo. All stabilization strategies failed and identification of the metabolite led to the conclusion that the degraded product is a radiolabeled tyrosine residue. Second peptide identified through Phage Display with the Ph.D.12 library was PDGFR-P1. Due to identification in previous, independent pannings against PDGFRβ, aim was the validation of binding to both targets: CD276 and PDGFRβ. Peptide arrays confirmed binding to both proteins but not to the control protein FGFR. Furthermore single amino acid exchange and fragment scan led to a modified peptide G2 with higher affinity then the original peptide. G2 as well as a fragment of G2, the peptide AV2, were characterized in vitro as well as in vivo.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mier, PD Dr. Walter
Date of thesis defense: 22 November 2012
Date Deposited: 28 Nov 2012 09:46
Date: November 2012
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
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